枳(Poncirus trifoliata)ptr-miR04抗寒功能验证及作用机制解析

摘要

MicroRNA(miRNA)在动植物体内大量存在，并且参与调节植物生长发育及胁迫应答等过程，但关于柑橘抗寒资源一枳（Poncirus trifoliata）低温响应miRNA的研究目前还比较少。本论文在前期研究的基础上，验证了枳中鉴定出的一个低温诱导新microRNA（即ptr-miR04）的抗寒功能，并初步解析了它的调控机制。主要结果如下:
　　1.利用pre-miR04前体转化的T2代转基因烟草植株进行低温处理，表型比较及生理指标（电导率、ROS等）分析表明转基因植株的抗寒性弱于野生型，暗示ptr-miR04负调控植物抗寒性。
　　2.在柠檬中超表达pre-miR04得到了转基因阳性植株。低温处理后，发现转基因柠檬植株叶片萎蔫程度比野生型严重，而电导率、ROS的含量比野生型高，说明超表达ptr-miR04降低了植株抗寒性。利用STTM技术构建了ptr-miR04干涉载体并转化枳，得到了阳性植株。
　　3.生物信息学预测ptr-miR04的靶基因，发现其中一个靶基因为果糖-1，6-二磷酸醛缩酶（fructose-bisphosphate aldolase，FBA），低温处理后对枳pre-miR04和FBA进行表达量分析，结果表明两者呈现负相关性。瞬时表达验证发现pre-miR04与FBA共表达注射烟草的荧光信号强度低于其他对照组，表明ptr-miR04与FBA之间存在互作关系。
　　4.低温处理前，转基因材料中可溶性糖含量均明显高于野生型，而低温处理后反而显著低于野生型。猜测ptr-miR04对植株糖代谢途径有影响。
　　综上，ptr-miR04是参与响应低温的负调控因子，其靶基因FBA则是正调控因子，在植株中超表达ptr-miR04前体基因，FBA表达受到抑制，植株抗寒能力下降。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1 前言

1．2．1 植物低温胁迫研究进展

1．2．2 柑橘低温胁迫研究进展

1．2．3 miRNA研究进展

1．2．4 糖代谢与植物逆境应答

1．3 本研究的目的与意义

2 实验材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 试剂

2．1．3 载体及菌株

2．2 方法

2．2．1 材料培养与处理

2．2．2 植物RNA提取及cDNA合成

2．2．3 植物材料相关基因表达模式分析

2．2．4 枳ptr-miR04靶基因预测

2．2．5 载体构建

2．2．6 大肠杆菌转化及阳性鉴定

2．2．7 重组质粒转化农杆菌

2．2．8 瞬时转化验证ptr-miR04与靶基因互作

2．2．9 农杆菌介导的柑橘遗传转化

2．2．10 转基因植株阳性鉴定

2．2．11 生理指标测定

2．2．12 统计分析

3 结果与分析

3．1 烟草T2代转基因植株抗寒性验证

3．1．2 转基因烟草低温处理表型鉴定

3．1．3 烟草抗寒生理指标测定

3．2 转基因柠檬抗寒性验证

3．2．1 pre-miR04超表达载体转柠檬及植株阳性鉴定

3．2．2 转基因柠檬抗寒性分析

3．3 ptr-miR04靶基因预测及验证

3．3．1 ptr-miR04靶基因预测

3．3．2 枳基因表达量分析初步验证ptr-miR04靶基因

3．3．3 烟草瞬时表达验证ptr-miR04及靶基因F鲋的互作

3．3．4 转基因烟草中pre-miR04与靶基因表达量分析

3．4 转基因材料糖含量分析

3．4．1 转基因烟草糖含量分析

3．4．2 转基因柠檬糖含量分析

3．5 STTM-miR04干涉载体构建及枳遗传转化

3．5．2 STTM-miR04干涉载体转化枳及转基因植株鉴定

4 讨论

4．3 miR04可能参与响应多种逆境胁迫

参考文献

附录

致谢