漆酶GhLac1介导棉花广谱抗性的机制解析

摘要

生长在自然环境中的植物，无时不刻都在遭受着病原菌和植食性昆虫的侵害。在长期的共进化和互相选择的过程中，植物建立起了一个复杂而精密的调控网络去感知和响应不同的生物胁迫类型，并迅速的激活植物体内相应的应答路径，在转录水平、蛋白水平和代谢水平上建立起新的生理生化平衡。在大田环境中，多种病虫害并存，提高植物的广谱抗性能力才能适应复杂多变的自然环境。本研究从棉花原生质体细胞壁重建的抑制消减杂交文库中克隆了一个能够促进细胞壁合成的基因GhLac1，并对其在介导棉花广谱抗性中的作用机制进行了研究，取得的主要结果如下:
　　1.鉴定到受多种处理诱导的漆酶基因GhLac1。
　　通过对陆地棉品系YZ1原生质体细胞壁重建的抑制消减杂交文库进行分析，发现了3条与GaLAC1（Gossypium arboretum secretory laccase，GI:40218370）具有较高同源性的EST(expressed sequence tag)序列(GI:213047554，GI:213047555和GI:213047556)。对这3条EST序列进行表达模式分析，发现GI:213047556受黄萎病菌、茉莉酸和H2O2诱导上调表达最为显著。因此，我们克隆了陆地棉GI:213047556的全长并命名为GhLac1。GhLac1编码一个含有566个氨基酸的蛋白，且含有植物漆酶典型的铜离子结合位点，以及N端分泌蛋白信号肽。进化分析表明，GhLac1与来源于可可的漆酶TvLac(GI:590604253)相似性最高。组织表达模式表明GhLac1在根系中表达量最高，其次是叶片。
　　2.超量表达GhLac1能够促进木质素合成并增强棉花的广谱抗性。
　　为了验证GhLac1在棉花中的功能，我们构建了烟草花叶病毒35S启动子驱动的GhLac1超量表达(35S∷GhLac1)和RNAi抑制表达(35S∷RNAi GhLac1)载体，并获得了相应的超量表达株系(OL-12、OL-13和OL-56)和RNAi抑制表达株系（iL-1和iL-11）。后续研究发现，GhLac1超量表达材料中木质素含量增加，这与已报道的植物漆酶能够促进木质素单体聚合的功能相吻合。抗性鉴定表明，超量表达GhLac1提高了转基因棉花对黄萎病菌、棉铃虫和棉蚜的抗性。
　　3.抑制GhLac1表达能够促进棉花黄酮类次生代谢物及茉莉酸合成并增强转基因材料对黄萎病菌和棉铃虫的抗性。
　　在抑制GhLac1表达后，转基因材料的木质素含量减少，但是苯丙烷代谢路径上游基因的表达水平和蛋白酶活明显增加。后续实验也证实了，在GhLac1抑制表达材料中总黄酮的含量增加，并具有抑制黄萎病菌和棉铃虫生长的作用。此外，我们还发现在GhLac1抑制表达材料中，茉莉酸和茉莉酸异亮氨酸含量增加，茉莉酸介导的信号路径组成性激活。因此，抑制GhLac1表达增强棉花对黄萎病菌和棉铃虫抗性增强可能与黄酮等次生代谢物的积累和茉莉酸信号路径的组成性激活有关。
　　4.抑制GhLac1表达导致棉花对棉蚜的敏感性。
　　对GhLac1抑制表达材料进行蚜虫接种鉴定，结果表明，与对照材料相比，转基因材料更感蚜虫。这可能是由于抑制GhLac1表达导致转基因材料中木质素含量减少，有利于蚜虫口器的刺入，方便蚜虫的取食;此外，在GhLac1抑制表达材料中，由于茉莉酸信号路径组成性激活间接抑制了在抗蚜虫中具有重要作用的水杨酸信号路径，因而导致GhLac1抑制表达材料更感蚜虫。
　　5.GhLac1抑制表达材料中茉莉酸含量增加依赖于细胞壁多糖含量的增加。
　　病原菌入侵或植食性昆虫取食造伤的细胞壁损伤，会造成胞壁区间内细胞壁多糖含量的增加，而位于细胞膜上的相关受体能够识别这种多糖信号并激活植物免疫系统。细胞壁多糖含量测定表明，与对照材料相比，GhLac1抑制表达材料中水溶性和EDTA溶解性细胞壁多糖含量最高，而GhLac1超量表达材料中含量最低。用转基因材料和对照材料的水溶性细胞壁多糖处理棉花悬浮培养细胞系，也证实了这种水溶性多糖能够促进茉莉酸的合成，且茉莉酸的含量和处理时所用水溶性多糖含量正相关。因此，我们推测GhLac1抑制表达材料中茉莉酸含量增加是由于木质素含量减少，细胞壁结构松弛，导致水溶性和EDTA溶解性细胞壁多糖含量增加并激活了植物体内茉莉酸合成路径。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 植物抗病反应机制

1．1．1 植物的先天免疫

1．1．2 水杨酸和茉莉酸介导的抗病信号路径及其交互作用

1．1．3 其他激素介导的抗病信号路径及其交互作用

1．1．4 病原菌“修饰”抗病信号路径突破植物防守

1．2 植物与植食性昆虫间的互作

1．3 棉花与黄萎病菌间的互作概述

1．3．1 黄萎病菌及其致病机理研究进展

1．3．2 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性

1．3．3 棉花对黄萎病菌的生理生化抗性

1．3．4 棉花中R基因介导的黄萎病菌抗性

1．3．5 激素信号路径在棉花抗黄萎病中的作用

1．4 棉花生产上的主要虫害及其防治

1．4．1 棉花生产上主要虫害及现状

1．4．2 棉花对植食性昆虫抗性机制的研究进展

1．5 植物漆酶的性质、催化机理和功能

1．6 本研究的目的与意义

第二章 介导棉花广谱抗性漆酶基因GhLac1的克隆和功能验证

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料、载体和菌株

2．1．2 化学试剂

2．2 实验方法

2．2．1 GhLac1基因的分离、克隆、载体构建及转化

2．2．2 棉花DNA及RNA提取

2．2．3 RNA反转录与实时定量PCR分析(qRT-PCR)

2．2．4 棉花原生质体细胞壁重建观察

2．2．6 黄萎病菌的活化和培养

2．2．7 棉花黄萎病菌接种处理

2．2．8 转基因材料Southern和Northern杂交检测

2．2．9 昆虫的选择性和非选择性取食实验

2．2．10 木质素的组织化学染色及含量测定

2．2．11 苯丙氨酸解氨酶活性测定

2．2．12 棉花总黄酮及棉酚等代谢物含量测定

2．2．13 棉花内源激素及黄酮类物质含量质谱测定

2．2．14 甲醇提取物的抗病抗虫性鉴定

2．2．15 棉花黄酮类物质组织化学染色

2．2．16 细胞壁多糖物质的提取

2．2．17 棉花胚性愈伤悬浮细胞系培养及处理

2．3 结果与分析

2．3．1 GhLac1基因克隆及序列分析

2．3．2 GhLac1基因的组织表达模式和诱导表达模式

2．3．3 GhLac1稳定转化的转基因株系的获得与检测

2．3．4 GhLac1转基因材料对黄萎病菌抗性增强

2．3．5 GhLac1转基因材料对棉铃虫抗性增强

2．3．6 GhLac1正调控棉花对棉蚜抗性

2．3．7 GhLac1促进木质素合成与积累

2．3．8 超量表达或者抑制表达GhLac1影响苯丙烷路径的代谢流分配

2．3．9 GhLac1抑制表达材料对黄萎病菌和棉铃虫抗性增强依赖于激活的茉莉酸信号路径

2．3．10 GhLac1异位表达造成的细胞壁结构变化可作为逆境触发器影响植物体内JA合成

2．3．11 GhLac1抑制表达材料对黄萎病菌和棉铃虫抗性增强依赖于黄酮等次生代谢物质的积累

2．3．12 GhLac1抑制表达材料中大量积累黄酮类物质并不影响其对蚜虫的抗性

2．3．13 GhLac1抑制表达材料中SA信号路径被抑制

2．3．14 GhLac1介导的棉花对黄萎病菌、棉铃虫和棉蚜的抗性机制总结

2．4 讨论

2．4．1 植物漆酶功能的多样性

2．4．2 次生代谢物质在植物抗病、虫方面功能的多样性

2．4．3 细胞壁损伤可以作为逆境触发器影响植物的抗性响应

2．4．4 介导棉花广谱抗性相关基因的挖掘

参考文献

附录

已发表和待发表论文

已申请专利

致谢