山羊抗胃肠道线虫(GINs)感染候选基因筛选及效应研究

摘要

胃肠道线虫(GINs)是影响小型反刍动物经济的重要寄生虫之一，也是世界上许多地区动物健康问题的主要来源。该寄生虫感染的抗性或易感性与遗传因素有关，且在品种与品种之间、个体与个体之间有差异。了解抗GINs感染的遗传机制对于有效和可持续地控制胃肠道线虫感染是十分重要的。然而，宿主对GINs感染的反应的分子机制目前尚不十分清楚。本研究对山羊GINs感染的候选基因、通路、特异性抗体反应及可能的机制进行了研究。
　　(1)通过粪便虫卵计数法筛选鉴定了宜昌白山羊(YWGs)品种内的抗性和易感个体。对选择的山羊检测寄生虫学参数和血液学参数，并由感染试验和转录组分析来对抗性组和易感组的的GINs感染情况进行分析。同时评估局部mIgA和系统性sIgE对GINs感染过程中的特异性抗原的保护机制和调节活性。本研究中共有来自不同地点的384只山羊用于鉴定ATP2A3基因中的单核苷酸多态性和它们与GINs感染性状的相关性。现场试验结果表明，抗性组较易感组的虫卵量及虫卵产生均有降低。与抗性山羊相比，易感山羊的血液学参数在观察期间的，血红蛋白（Hgb）有显著降低(p＜0.01)，填充细胞容积(PCV)百分比较低(p＜0.05)，同时发现易感的山羊血红蛋白低于正常血红蛋白值（90-150g/L）。线虫感染试验后，抗性组山羊捻转血矛线虫数量显著低于易感组山羊(p＜0.05)。在本研究的三个性状中，粪便虫卵计数(FEC)与血红蛋白呈负相关(r=-0.94)，粪便虫卵计数(FEC)与填充细胞容积呈负相关（r=-0.90），其中血红蛋白与填充细胞容积呈正相关(r=0.94)。
　　(2)在GINs感染抗性组和易感组中各选择四个极端个体，进行血液转录组分析以比较其mRNA表达谱。转录组分析显示，两组共有显著差异(p＜0.001)表达的基因2369个，其中上调基因1407个，下调基因962个。在抗性组中高表达的298个基因的功能注释产生了46个显著的(p＜0.05)功能注释簇，包括涉及免疫生物合成过程以及一些与免疫系统相关的途径的31个基因（先天免疫9个，获得性13个，先天免疫9个），如转化生长因子(TGF)-β，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞粘附分子(CAMs)。这些发现提供了与改善宿主对GINs感染的抗性相关的认识，并为进一步了解山羊对GINs感染抗性机制打下了基础。
　　(3)从转录组分析得到的差异表达基因中选择12个上调和下调的基因，通过qRT-PCR来进行验证。在选择的基因中，与抗性组山羊相比，6个上调基因（ITGA4，C3，BCL2，ATP7A，ERAP1和ST6GAP1）在易感山羊中高表达，另外6个下调基因（LST1，IFI44L，IL1R2，F12，CCL27和IFI6）在易感山羊中低表达。ITGA4，C3，BCL2，ST6GAL1，LST1，IFI44L，IL1R2和IFI6基因在p＜0.01水平显著差异表达，ATP7A，ERAP1，F12和CCL27在p＜0.05水平显著差异表达，同转录组分析结果相一致。将qRT-PCR log2表达（倍数变化）数据和mRNA序列log2表达（倍数变化）数据拟合在线图和表达模式中，相关系数为0.912，线性回归模型为Y=0.839X-2.252，与测序表达结果呈显著的相关性。
　　(4)局部粘膜免疫球蛋白-A(mIgA)和全身性血清免疫球蛋白-E(sIgE)是针对GINs感染的最重要的应答抗体。本研究调查了局部mIgA和系统性sIgE，监测了局部mIgA和系统sIgE针对特定抗原的反应，发现两者与GINs感染的成年期、生殖力和虫体长度呈负相关，表明其调节抗寄生虫感染方面的作用。
　　(5)应用qRT-PCR在山羊中检测了5个感染相关基因的相对情况，结果表明，在易感山羊中C3，LTBP2，ABCB1和SMAD3基因的表达水平较高，但IL1R2基因在抗性山羊中高表达。皱胃组织（胃底和幽门组织），淋巴结（胃肠和肠系膜）和小肠组织中的C3和IL1R2基因的mRNA相对表达谱显示出显著差异，而基因LTBP2，ABCB1和SMAD3在易感山羊和抗性山的淋巴结和小肠组织中没有显示出差异。总体来说，抗原特异性局部mIgA和全身sIgE以及组织特异性应答，特别是C3和IL1R2应答，在山羊GINs感染的遗传抗性机制中具有重要效应。
　　(6)检测了ATP2A3基因的多态性，并研究了其与三个中国山羊群体中GINs感染的关系。在山羊ATP2A3基因中发现了7个新的变异，其中5个位于3'UTR区域，2个位于外显子区且为同义突变。7个变异的基因型和等位基因频率与Hardy-Weinberg平衡及群体遗传学参数相一致，如多态性信息量(PIC)在恩施黑山羊、南江黄羊及宜昌白山羊中分别为0.26，0.32和1.54，杂合度(He)在恩施黑山羊、南江黄羊及宜昌白山羊中分别为0.28，0.35和1.60，有效等位基因数(Ne)在恩施黑山羊、南江黄羊及宜昌白山羊中分别为0.28，0.34和1.55。
　　(7)关联分析显示，在7个多态性位点中有4个多态性位点对山羊GINs感染有显著影响。从7个单核苷酸多态性的单倍型和LD结构来看，3'非编码区C24361893T和C24379974T以及3'UTR区的C24358400A和G24358441C两对变异体之间存在显著的连锁不平衡，及较高的连锁不平衡系数(D')，并分别跨越了18.081kb(～18kb)和0.041kb(～0kb)的两个区域。从ATP2A3基因的4个多态性位点及其单倍型组合中，从这4个突变构建了8个以前未发现的单倍型，其中AG和CC单倍型频率最高，分别为65.0％和53.3％，其次是其他单倍型。通过qRT-PCR分析，ATP2A3基因的mRNA的相对表达量在易感山羊中高于抗性山羊，并且在p＜0.05水平上与转录组测序数据的相对倍数变化有显著不同。这些结果表明，ATP2A3基因在山羊抗GIN感染过程中是一个关键候选基因。

目录

声明

LIST OF CONTENTS

ABSTRACT

摘要

ABBREVIATION

CHAPTER 1

1．Background Information

1．1 General Introduction

1．2 Problem Statement

1．3 Justification

1．4 Objectives

1．5 The Overall Outline of This Dissertation

CHAPTER 2

2．1 Introduction

2．2 Current Goat Population Status

2．3 Current Production Status of Goat

2．4 Importance of Goat Production

2．5 Gastrointestinal Nematodes(GINs)in Goat Production

2．6 Life Cycle of Haemonchus contortus in Goat

2．7 Control Methods for GINs

2．8 Phenotypic Indicators of Resistance

2．9 Immune Response to Haemonchus contortus

2．10 Genetic Resistance to GINs Infection

2．11 Heritability in FEC of Genetic Resistance

2．12 Identification of QTL Associated with GIN Resistance

2．13 Polymorphisms and Genetic Association

2．14 Identified Loci Underlying Variation in Resistance to GINs

2．15 Transcriptome Study

2．16 Summary

CHAPTER 3

3．2 Introduction

3．3 Materials and Methods

3．4 Results

3．5 Discussion

3．6 Conclusions

CHAPTER 4

4．2 Introduction

4．3 Materials and Methods

4．4 Results

4．5 Discussion

4．6 Conclusion

CHAPTER 5

5．2 Introduction

5．3 Materials and Methods

5．4 Results

5．5．Discussion

5．6 Conclusion

CHAPTER 6

6．General Conclusion and Innovation of the Study

6．1 General Conclusion

6．2 Innovations of the Study

CHAPTER 7

7．Recommendation and Future Direction

7．1 Recommendation

7．2 Future Direction

References

APPENDICES

ACKNOWLEDGEMENTS

Curriculum Vitae

About Author