SIRT1调节线粒体自噬对猪肠上皮细胞氧化损伤的影响

摘要

肠道是应激反应的中心器官。当机体受内外环境不利因素刺激时，极易导致肠道结构及功能的损伤，诱发全身肠源性应激综合征甚至危及生命，因此健康有序的肠道结构和功能的稳定对维持动物生长、发育、繁殖以及免疫功能具有重要意义。线粒体作为细胞呼吸和能量产生的重要场所，其内膜呼吸链的氧化磷酸化是活性氧自由基(ROS)产生的主要来源，线粒体介导的选择性自噬在降解受损或多余线粒体、维护线粒体数量和质量的平衡以及细胞氧化损伤调节中发挥重要作用。研究发现沉默信息调节因子1(SIRT1)与线粒体自噬密切相关，并参与了细胞氧化损伤过程，但SIRT1调节线粒体自噬在肠道氧化损伤中的作用有待阐明。本研究主要探讨SIRT1与猪肠上皮细胞线粒体自噬的关系，分析SIRT1对猪肠上皮细胞氧化损伤的影响，为阐明肠道氧化损伤的分子机理及抗氧化产品的研发提供思路与科学依据。
　　主要研究内容:
　　1.氧化应激对猪肠上皮细胞氧化损伤、线粒体自噬及SIRT1/PGC-1α通路的影响
　　用浓度为300μM H2O2处理IPEC-1细胞12h，收取细胞样品。分别用DCFH-DA与JC-1探针检测细胞线粒体内活性氧自由基水平及膜电位变化情况;qPCR和Western Blot分析肠黏膜紧密连接蛋白(ZO-1、Claudin-1和Occludin)、自噬标志分子（LC3、Beclin1和p62）、线粒体自噬通路(PINK1/Parkin)、SIRT1及其下游PGC-1α分子的表达变化。实验结果显示:(1)氧化应激导致猪肠上皮细胞ROS水平增加、线粒体膜电位水平降低;肠黏膜屏障紧密连接分子mRNA和蛋白质的表达受抑制;(2)线粒体自噬标志分子LC3、Beclin1、PINK1、Parkin的表达水平均显著上调，而p62表达降低;(3)SIRT1及其下游PGC-1α分子的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。上述结果表明:氧化应激使猪肠上皮细胞遭受氧化损伤，导致线粒体膜电位下降，肠上皮细胞间紧密连接完整性被破坏，激活线粒体自噬水平，同时抑制SIRT1/PGC-1α信号通路分子的表达。
　　2.SIRT1对猪肠上皮细胞线粒体自噬的影响
　　为进一步阐明SIRT1在猪肠上皮细胞线粒体自噬中的作用，首先利用不同浓度的SIRT1特异性小分子激活剂SRT1720（0μM、1.25μM、2.5μM、5μM）和抑制剂EX527(0μM、1μM、5μM、10μM、20μM)分别处理IPEC-1细胞，24h后提取RNA和蛋白质，qPCR和Western Blot分析SIRT1及PGC-1α的表达水平，筛选激活剂及抑制剂的最佳效应浓度;其次用该浓度处理细胞12h后加入300μMH2O2，12h后收集样品，qPCR和Western Blot分析自噬标志分子LC3、ATG5及线粒体自噬PINK1/Parkin通路的表达情况。实验结果显示:(1)SIRT1/PGC-1α通路的表达水平随激活剂SRT1720与抑制剂EX527浓度的增加呈现上调和下降趋势，并于SRT1720浓度为1.25μM、EX527浓度为1μM时的激活和抑制效果最为显著。(2)激活SIRT1可增加线粒体自噬标志分子(LC3、ATG5)和PINK1/Parkin通路蛋白的表达水平，而抑制SIRT1时则出现相反效应。该结果表明，激活SIRT1后可进一步增强氧化应激诱导的猪肠上皮细胞线粒体自噬水平。
　　3.SIRT1对猪肠上皮细胞氧化损伤的影响
　　由于氧化应激导致猪肠上皮细胞黏膜屏障受损及线粒体膜电位水平降低，同时抑制了SIRT1分子的表达，并且SIRT1能激活线粒体自噬水平，但SIRT1是否参与猪肠上皮细胞抗氧化损伤作用尚待进一步阐明。用SIRT1激活剂和抑制剂分别处理细胞，12h时加入300μM H2O2，12h后收集细胞样品，分别用DCFH-DA与JC-1探针检测细胞线粒体内ROS水平及膜电位变化情况，qPCR和Western Blot分析肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin基因及Claudin-1蛋白的表达情况。实验结果显示，在氧化应激状态下激活SIRT1后，细胞内ROS含量降低，线粒体膜电位水平升高，紧密连接蛋白基因表达水平均明显上调，而抑制SIRT1则出现相反效应。该结果表明:激活SIRT1可显著逆转猪肠上皮细胞的氧化损伤状态，受抑制时则进一步加重损伤，SIRT1在猪肠道细胞应激过程中可发挥抗氧化应激的防御作用。
　　结论:
　　1.氧化应激导致猪肠上皮细胞氧化损伤:降低线粒体膜电位、破坏细胞间紧密连接完整性;激活细胞线粒体自噬水平;抑制SIRT1/PGC-1α信号通路分子的表达。
　　2.激活SIRT1可进一步增强氧化应激诱导的猪肠上皮细胞线粒体自噬水平。
　　3.激活SIRT1可能通过增强线粒体自噬发挥对猪肠上皮细胞氧化损伤的修复作用。

目录

声明

摘要

主要缩略语表(Abbreviations)

1 文献综述

1．1 研究问题的由来

1．2 肠上皮细胞黏膜屏障及紧密连接简介

1．3 氧化应激对肠道结构及功能的影响

1．3．1 氧化应激简介及其危害

1．3．2 氧化应激对肠道结构及功能损伤的影响

1．4 氧化应激与线粒体自噬概述

1．4．1 细胞自噬与线粒体自噬

1．4．2 氧化应激对线粒体自噬的影响作用

1．5 SIRT1在肠道氧化损伤中的作用

1．5．2 SIRT1在肠道损伤中的作用

1．5．3 SIRT1与线粒体自噬

1．6 研究目的和意义

2 实验材料

2．1 引物及核苷酸序列

2．2 细胞

2．3 主要试剂和药品

2．4 主要培养基和缓冲液

2．5 主要仪器

3 实验方法

3．1 细胞培养

3．2 细胞总RNA提取和反转录

3．2．1 提取细胞总RNA

3．2．2 反转录

3．3 荧光定量PCR(qPCR)

3．4 细胞总蛋白提取

3．5 BCA法测定蛋白浓度

3．6 蛋白免疫印迹(Western Blot)

3．6．1 SDS-PAGE电泳

3．6．2 转膜

3．6．3 杂交

3．6．4 显影

3．7 细胞活性氧(ROS)水平检测

3．8 线粒体膜电位检测

3．9 数据统计

4 结果与分析

4．1 氧化应激对猪肠上皮细胞损伤的影响

4．1．1 氧化应激对细胞ROS产生及线粒体膜电位水平的影响

4．1．2 氧化应激对猪肠上皮细胞黏膜屏障的影响

4．2 氧化应激对猪肠上皮细胞线粒体自噬的影响

4．3 氧化应激对猪肠上皮细胞SIRT1／PGC-1α通路的影响

4．4 激活剂与抑制剂对猪肠上皮细胞SIRT1／PGC-1α通路的影响

4．5 激活S1RT1可增强氧化应激诱导的猪肠上皮细胞线粒体自噬水平

4．6 SIRT1对猪肠上皮细胞氧化损伤的修复作用

4．6．2 激活SIRT1对细胞黏膜屏障的影响

5 讨论

5．1 氧化应激对猪肠道损伤的影响

5．2 氧化应激与线粒体自噬的联系

5．3 SIRT1抗氧化应激作用与线粒体自噬的联系

5．4 SIRT1对猪肠上皮细胞氧化损伤的作用

6 结论

参考文献

攻读硕士学位期间已发表论文

致谢