硫化叶菌Ⅲ-B型Cmr-α复合物核酸干涉机制的研究

摘要

CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated)系统是原核生物所特有的一种后天免疫系统，广泛存在于古菌和细菌中，能够抵御质粒、病毒等外源遗传物质的入侵。每套CRISPR-Cas系统至少包括CRISPR簇和cas基因两个遗传单位。在最新的分类中，CRISPR-Cas系统被分为两大类，六种不同的主要类型。其中，只有Ⅲ型CRISPR-Cas系统既具有RNA切割活性又具有DNA切割活性，是目前已知的唯一具有双核酸干涉活性的CRISPR-Cas系统。之前研究表明，冰岛硫化叶菌REY15A菌株的Ⅲ-B型Cmr-α系统能够规律间隔6nt切割靶标ssRNA，且crRNA一旦与同源的靶标RNA结合，被激活的三元复合体(Cmr-α∷target RNA)显示出很高的非特异性ssDNA切割活性。而Cmr-α系统的这种双核苷酸切割活性是如何被调控的，至今还有许多未知。本论文经研究认为，Cmr1α能够作为一个整合激活模块来增强Cmr-α系统的核酸干涉活性，而Cmr4α在Cmr-α系统免疫过程中复杂激活的时空调控中发挥重要作用。
　　为了研究Cmr复合体的非必须亚基Cmr1的功能，本研究在冰岛硫化叶菌(S.islandicus REY15A)中首先构建了一个缺失突变株ΔβΔ1α。体内干涉活性分析表明，ΔβΔ1α缺失突变株仍然能够干涉靶标RNA和入侵质粒，但其活性都大大降低，但仍可以从ΔβΔ1α缺失株中纯化得到不含有Cmr1α的稳定核心核酸蛋白复合体Cmr-αΔ1(Cmr2α-6α)。体外生化分析发现，Cmr-αΔ1复合体中的crRNA发生大量降解，但是仍然具有微弱的切割ssRNA和ssDNA的活性，与体内的干涉活性相一致。经过保守氨基酸和蛋白结构模拟分析显示，Cmr1αN端的第一个α-螺旋上的氨基酸相当保守，并位于Cmr1α蛋白的表面凹槽内。分析部分保守氨基酸的体内体外数据表明，Cmr1α的两个保守疏水氨基酸（W58和F59）对体内的入侵质粒沉默活性和体外切割DNA的影响较大，主要负责Cmr1α与靶标RNA的结合;另外四个高度保守氨基酸(I52，G54，R57和R61)则对靶标RNA的体内干涉活性和体外切割活性影响更大，主要负责Cmr1α与crRNA的结合。Cmr1α虽然不是Cmr-α复合体所必须的，但是一旦与核心复合体结合，能够大大增强Cmr-α复合体依赖于crRNA与目标RNA结合的核酸干涉活性。此外，Cmr1的存在与微生物嗜热生活方式的相关性，也反映了Ⅲ型CRISPR-Cas系统的进化适应性。
　　Cas10蛋白家族（Csm1和Cmr2）作为Ⅲ型CRISPR-Cas系统的特征蛋白，其两个保守结构域分别负责非特异性ssDNA切割和激活非特异性ssRNA切割的第二信使cOAs合成。该第二信使能够激活Csx1的CARF结构域而大量非特异性降解ssRNA。本研究数据表明，当靶标RNA表达不活跃时，Cmr2α的Palm2结构域起主要沉默作用;而当靶标RNA表达活跃时，Cmr2α的HD结构域的活性显著增强，也会致死宿主细胞。
　　Cmr4作为Ⅲ-B型Cmr复合体的大亚基骨架蛋白，对于复合体的组装和稳定性非常重要。通过选取一些Cmr4同源蛋白进行多序列比对，本研究确定了一系列保守的功能氨基酸残基。通过体内活性分析，结果显示突变这些SisCmr4α保守氨基酸会严重影响Cmr-α系统的体内干涉活性。通过纯化来自突变体的效应复合物时，发现只有从Δβ4α-D83A和Δβ4α-H16A两个突变株中才能纯化得到稳定的Cmr-α复合体。这表明大多数cmr4α的突变可能会影响效应复合物的结构。此外，本研究得到的突变效应复合物中，只含有3个Cmr4α的小复合体的比例较高，而野生型Cmr-α效应复合物中含有4个Cmr4α的大复合体的比例较高，但突变复合体与野生型复合体在体外切割核酸的模式一致。
　　为研究由Cmr4α_D27A突变对细胞的致死，我们在Δβ4α-D83A突变株基础上成功突变D27A得到双突变株Δβ4α-D27/83A，却无法从双突变株中纯化得到完整的Cmr-α复合体。这说明D83A点突变很可能影响了Cmr-α复合体的稳定性，或者D27A突变加剧了复合体的不稳定性。Cmr2α的HD结构域和Palm2结构域均突变的菌株，既失活了DNase活性也失活了c-A4的合成活性，从而可以在该双突变株体内成功突变Cmr4α_D27A。结合凝胶迁移阻滞结果分析可知，该突变株呈现出独特的Cmr-α复合体和靶标RNA结合模式。这一结果为进一步研究靶标RNA的结合、切割以及产物释放提供了重要的依据。
　　Ⅲ型CRISPR-Cas系统被公认为是一个需要靶标RNA激活的免疫系统。它能够依赖于靶标RNA与crRNA的结合，激活非特异性ssDNA切割，并在切割靶标RNA并释放产物后，失活DNase活性。因此，Ⅲ型系统的核酸蛋白复合物切割非特异ssDNA的速度非常快，并通过切割靶标RNA而失活自身沉默活性来避免“自我免疫”。Cmr4α_D27A突变后，Cmr-α突变复合体不能有效切割靶标ssRNA，复合体始终被激活而不断大量地切割非特异性ssDNA，对自身基因组造成不可逆损伤，从而导致宿主细胞死亡。综合以上结果表明，Cmr4α在Cmr-α免疫过程中对Cmr-α的核酸酶活性和环化酶活性的时空调控起着至关重要的作用。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 古菌

1．1．1 古菌概述

1．1．2 硫化叶菌

1．2 CRISPR-Cas系统

1．2．1 CRISPR-Cas系统的发现

1．2．2 CRISPR-Cas系统的结构和功能

1．2．3 CRISPR-Cas系统的分类和进化

1．3 CRISPR-Cas系统的机制研究

1．3．1 新间隔序列的获取

1．3．2 crRNA的加工

1．3．3 核酸的干涉

1．4 Ⅲ型CRISPR-Cas系统的干涉机制

1．4．1 复合体的组装

1．4．2 自我识别机制

1．4．3 核酸干涉机制

1．5 S．islandicus REY15A的CRISPR-Cas系统

1．6 CRISPR-Cas系统的应用

1．7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 菌株和质粒

2．2 培养基配方及培养条件

2．2．1 大肠杆菌的培养基及培养条件

2．2．2 硫化叶菌的培养基及培养条件

2．3 主要分子生物学试剂

2．4 主要实验仪器

2．5 实验方法

2．5．1 大肠杆菌JM109的感受态制备和转化

2．5．2 硫化叶菌感受态的制备和电击转化法

2．5．3 含人工mini-CRISPR的干涉质粒和互补质粒的构建

2．5．4 基因编辑质粒的构建

2．5．5 提取硫化叶菌总DNA

2．5．8 β-半乳糖苷酶酶活分析

2．5．9 天然Cmr-α复合物的纯化

2．5．12 Cmr-α复合物的ssRNA切割活性分析

2．5．15 Cmr-α复合物的环腺苷酸合成活性分析

3 结果与分析

3．1．1 缺失Cmr1α能够差异影响SisCmr-α复合物的核酸干涉活性

3．1．2 Cmr2α-6α形成的核心核蛋白复合物展现较低核酸切割活性

3．1．3 Cmr1α的不同保守位点对Cmr-α复合体的核酸干涉影响不同

3．1．4 Cmr1α突变的Cmr-α复合体展现独特的核酸切割活性

3．2 Cmr4α在Cmr-α复合体变构激活调控过程中的重要功能

3．2．1 Cmr4α的保守位点对Cmr-α复合体干涉活性的差异影响

3．2．2 Cmr4α突变的Cmr-α复合体展现独特的核酸切割活性

3．2．3 Cmr4α-D27A突变亚基只有在形成三元复合物时才会致死细胞

3．2．4 Cmr4α_D27A突变能够加剧Cmr-α复合体的不稳定性

3．2．5 Cmr4α-D27A突变能够增强Cmr2αHD结构域的致死活性

3．2．6 Cmr-α系统存在干涉RNA的潜在活性位点

3．2．7 Cmr4α_D27A突变复合体与靶标RNA呈现独特的结合模式

4 讨论与展望

4．1 Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统的进化适应性

4．2 冰岛硫化叶菌Ⅲ-B型Cmr-α系统的干涉机制

4．3 Ⅲ型CRISPR-Cas系统激活调控机制的生物学意义

参考文献

附录

博士期间成果

致谢