阿维链霉菌固态发酵工艺及抗线虫活性研究

摘要

近年来，随着人们对环境保护、食品安全的重视，农药向着无毒易降解制剂的方向发展。阿维菌素作为高效低毒易降解的生物农药，已得到深入的研究与广泛的应用。阿维菌素是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的一类具有广谱杀虫作用的抗生素，它包括8个组分，其中B1组分对线虫的防治最为有效。目前，阿维菌素产品主要是利用液态发酵进行生产获得的，但是液态发酵对环境带来较大的危害，例如生产过程产生的废渣废水较多，同时在阿维菌素生产、制剂化过程中需添加大量的难以降解的有机溶剂，这些有机溶剂给应用的植物和土壤带来较大的危害。因此开发生产过程废渣废液产生少、有机溶剂环境污染风险小、具有较好抗虫效力的优良产品的新型发酵工艺成为当前阿维菌素生产工艺研究的热点。固态发酵方式常用于放线菌产抗生素的生产，具有废渣、废液少、外源有机溶剂添加剂少、环境兼容性好等优点，因此本工作拟采用固态发酵方式，期望找到一种环境兼容性较好的阿维菌素生产方式。
　　本文主要对阿维链霉菌AVM5的固态发酵生产工艺条件进行了研究，以菌数为指标优化了固态发酵培养基成分和发酵条件，利用HPLC分析检测了阿维菌素的产量，并将固态发酵产物和含线虫土样混合，探究其抗线虫效果。具体研究结果如下:
　　1、采用单因素和正交试验两种优化方法，选择了固态发酵培养基组分和发酵条件。确定了固态发酵条件为用罐头瓶在28℃下培养，种龄96h，接种量20mL，初始含水量45％，初始pH7.3，培养周期为10d;确定了固态发酵培养基组分为碳源是11g大米粉混配7g木薯渣，氮源是11g豆粕粉混配9g牛肉浸粉，无机盐添加量分别是0.40％NaCl、0.50％K2HPO4、0.50％MgSO4·7H2O、0.10％CaCl2、0.01％FeSO4·7H2O、0.04％CoCl2·6H2O;测定了阿维链霉菌固态发酵过程的生长曲线，确定菌体各生长阶段;经过上述优化后，最大产菌数为1.41×1010cfu/g干基，相比初始培养提高了29倍。
　　2、阿维菌素HPLC检测条件为Agilent ZORBAX Eclipse C18色谱柱，UV检测波长为245nm，流动相为甲醇∶水=95∶5，设置流速1.0mL/min、进样量20μL、柱温40℃;样品处理方法为用5倍甲醇浸泡，辅以超声处理25min，浸提2h，每30min振荡一次，过膜待测，进行HPLC检测分析;由固态发酵产物HPLC色谱图分析可知阿维菌素含量与菌数呈正相关，但是阿维菌素产生往往滞后于菌数量，即菌体裂解导致细胞数量减少，阿维菌素从胞内大量释放致使其含量提高;通过延长发酵周期，阿维菌素产量在40d左右达到最大，约0.62mg/g干基。
　　3、固态发酵产物与含线虫土样混合后，线虫数量明显降低，确定是产物中释放的阿维菌素具有杀虫效果，而非菌体直接触杀。固态发酵产物的杀虫效果最高可达37％，并且稀释100倍仍旧可以起到抗线虫作用。
　　通过上述工作，初步确定了阿维菌素的固态发酵工艺，为替代阿维菌素的液体发酵方式提供了指导，这将有利于环境兼容性好的阿维菌素产品的生产与应用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 阿维链霉菌概述

1．2 阿维菌素简介

1．2．1 阿维菌素结构组成

1．2．2 阿维菌素性质

1．2．3 阿维菌素用途

1．3 阿维菌素杀虫机制和生物活性

1．3．1 阿维菌素杀虫机制

1．3．2 阿维菌素生物活性

1．4 阿维菌素研究改造及生产应用

1．4．1 阿维菌素的研究进展

1．4．2 阿维菌素规模化生产工艺

1．4．3 阿维菌素市场应用情况

1．5 阿维菌素制剂

1．5．1 微生物农药制剂概况

1．5．2 阿维菌素制剂概况

1．5．3 阿维菌素制剂存在问题及应对策略

1．6 阿维菌素液态发酵生产特点

1．6．1 阿维菌素液态发酵优点

1．6．2 阿维菌素液态发酵缺点

1．7．1 固态发酵概况及现状

1．7．2 固态发酵工艺优化流程

1．8 本实验研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 仪器设备

2．2 阿维链霉菌固态发酵工艺优化

2．2．1 斜面及种子液制备

2．2．2 生物量测定方法

2．2．3 种子液的选择

2．2．4 固态发酵培养基初步优化

2．2．5 固态发酵生长曲线及pH变化情况

2．2．6 固态发酵培养条件的优化

2．2．7 固态发酵培养基二次优化

2．3 固态发酵产物中阿维菌素的检测

2．3．1 阿维菌素紫外波段扫描

2．3．2 HPLC流动相的选择

2．3．3 阿维菌素标准曲线的绘制

2．3．4 不同有机试剂提取阿维菌素效果的比较

2．3．5 超声波辅助提取阿维菌素效果的比较

2．3．6 固态发酵优化不同阶段阿维菌素产量

2．4 固态发酵产物抗线虫活性试验

2．4．1 线虫分离方法的选择

2．4．2 固态发酵产物对线虫的杀灭效果

2．4．3 不同浓度固态发酵产物对线虫的杀灭效果

2．4．4 不同发酵时间的固态发酵产物对线虫的杀灭效果

3 结果与分析

3．1 种子液的选择

3．2 固态发酵培养基初步优化

3．2．1 初始固态发酵培养基的确定

3．2．2 碳源种类及添加量优化

3．2．3 氮源种类及添加量优化

3．2．4 碳氮比的确定

3．2．5 无机盐离子种类及浓度的单因素优化

3．3 固态发酵生长曲线及pH变化情况

3．4 固态发酵培养条件的优化

3．4．1 接种量对菌数的影响

3．4．2 种龄对菌数的影响

3．4．3 培养方式对菌数的影响

3．4．4 培养周期对菌数的影响

3．4．5 培养条件的正交试验

3．5 固态发酵培养基二次优化

3．5．1 外加碳源优化

3．5．2 外加氮源优化

3．5．3 无机盐浓度正交试验

3．5．4 载体种类的选择

3．5．5 初始含水量优化

3．5．6 初始pH优化

3．6 固态发酵产物中阿维菌素的检测

3．6．1 阿维菌素紫外扫描

3．6．2 HPLC流动相的选择

3．6．3 阿维菌素标准曲线的绘制

3．6．4 不同有机试剂提取固态发酵产物中阿维菌素的效果

3．6．5 超声波辅助提取固态发酵产物中阿维菌素的效果

3．6．6 固态发酵优化不同阶段阿维菌素产量

3．7 固态发酵产物抗线虫试验

3．7．1 线虫分离方法的选择

3．7．2 固态发酵产物对线虫杀灭效果

3．7．3 不同浓度固态发酵产物对线虫杀灭效果

3．7．4 不同发酵时间固态发酵产物对线虫杀灭效果

4 小结与讨论

4．1 小结

4．2 讨论

参考文献

附件

致谢