柑橘砧穗间交流mRNA的鉴定

摘要

栽培柑橘由接穗与砧木嫁接而成，接穗和砧木的相互作用影响柑橘的园艺性状、生理活动和抗逆性等，尽管有关柑橘砧穗互作的研究国内外已有报道，但在分子层面的互作研究非常缺乏。前人研究表明园艺作物砧穗间普遍存在mRNA交流现象，但柑橘上是否也存在交流mRNA尚不清楚。本研究以柑橘品种红夏橙(Citrus sinensis Osbeck)和常用砧木枳(oncirus trifoliata L.Raf)为材料构建异源嫁接组合，通过基于转录组的单核苷酸多态性分析，初步鉴定了可在柑橘砧穗间交流的mRNA并探讨了其可能的作用，为深入研究柑橘砧穗互作机制提供了理论基础。
　　本论文主要研究结果如下:
　　1.构建了红夏橙/枳和枳/枳两种砧穗嫁接组合，分别对两种嫁接组合的接穗和砧木以及砧穗交界面取样进行转录组测序。以本研究获得的18个转录组数据以及前人发布的17个红夏橙转录组数据为基础，通过比对分析获得这两个材料的特征性SNP位点254580个。在红夏橙/枳异源嫁接组合中若接穗某mRNA拥有来自砧木的特征性SNP位点，则该mRNA可能由砧木转移至接穗，同理可检测由接穗转移至砧木的mRNA。结果筛选得到30个从红夏橙转移到枳以及24个从枳转移到红夏橙的mRNA。
　　2.在红夏橙/枳异源嫁接组合中，将红夏橙的mRNA与红夏橙基因组序列比对获得不能匹配的mRNA，再将这些不能匹配的mRNA与枳基因组比对，若能与枳匹配则该mRNA可能由砧木转移至接穗，同理可检测由接穗转移至砧木的mRNA。结果筛选得到3个从红夏橙转移到枳以及24个从枳转移到红夏橙的mRNA。
　　3.对于比较转录组分析筛选得到的柑橘砧穗交流mRNA，以特征性SNP作为判断标准，通过RT-PCR和建库测序实验进一步证实Cs2g02150.1和Cs5g20420.1的mRNA可从枳转移到红夏橙，Cs2g16070.1的mRNA可从红夏橙转移到枳;对于比较基因组分析筛选得到的柑橘砧穗交流mRNA，通过PCR检测发现红夏橙和枳的候选mRNA能匹配上，表明前期枳基因组数据不完整，用该枳基因组进行比较分析的方法不完善，无法筛选到柑橘砧穗间交流的mRNA。
　　4.对实验验证获得的3个柑橘砧穗交流mRNA进行蛋白质保守域预测，发现Cs2g16070.1编码邻甲基转移酶，Cs2g02150.1编码泛素蛋白，Cs5g20420.1编码尿苷二磷酸葡萄糖转移酶。为进一步探讨这些交流mRNA的功能，我们构建了这三个基因的超表达载体，遗传转化了拟南芥并获得了抗性苗，为下一步深入验证其功能提供了材料。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 柑橘砧穗间相互影响及作用

1．1．1 柑橘砧木对接穗生理生化特性的影响

1．1．2 柑橘接穗对砧木生理生化特性的影响

1．1．3 柑橘接穗与砧木之间相互作用的机制

1．2 砧穗间普遍存在mRNA交流现象

1．2．1 mRNA远距离运输对接穗／砧木发育的影响

1．2．2 mRNA远距离运输对接穗／砧木开花的影响

1．2．3 mRNA远距离运输对接穗／砧木胁迫反应的影响

1．3 研究目的与意义

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 数据

2．1．3 试剂盒、酶与载体

2．2 实验方法

2．2．1 枳参考基因的组装及注释

2．2．2 初步筛选柑橘砧穗间交流mRNA的生物信息学方法

2．2．3 柑橘砧穗间交流mRNA的实验验证方法

2．2．4 超表达分析方法

3 结果与分析

3．1 红夏橙与枳特征性SNP的筛选

3．2 柑橘砧穗间交流mRNA的初步筛选

3．2．1 基于比较转录组分析筛选柑橘砧穗间交流mRNA

3．2．2 基于比较基因组分析筛选柑橘砧穗间交流mRNA

3．3 柑橘砧穗交流mRNA的实验验证

3．3．1 基于转录组比较分析筛选的候选mRNA的验证

3．3．2 基于基因组比较分析筛选的候选mRNA的验证

3．4 可交流mRNA的生物信息学分析

3．5 可交流mRNA的超表达分析

4 讨论

4．1 柑橘砧穗交流mRNA的挖掘

4．2 柑橘砧穗交流mRNA鉴定方法的可靠性

4．3 柑橘砧穗交流mRNA的功能初探

4．4 未来工作展望

参考文献

附录

致谢