氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈对捕食性天敌异色瓢虫的潜在影响研究

摘要

为了满足世界各地日益增长人口的粮食需求，需要不断增加农作物的产量。为了挽回害虫爆发对农作物造成的损失，需要更多新型杀虫剂的研发和应用。然而杀虫剂对环境、人类健康和害虫天敌的不利影响已成为世界性的热点问题。害虫天敌与杀虫剂靶标害虫栖息于同一生境，天敌可能通过不同途径直接或间接暴露于这些杀虫剂中。杀虫剂对害虫天敌潜在的不利影响引起公众和科学家的高度关注，已有很多这方面的报道。氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈是两种广泛使用的农药，用于防治不同农作物的鞘翅目、鳞翅目、双翅目和半翅目害虫。异色瓢虫（鞘翅目:瓢虫科）是一种重要的生防因子，能够控制多种重要害虫，包括蚜虫、介壳虫、粉虱、粉蚧、螨虫和木虱类。它在包括中国、日本、美国、非洲、欧洲等很多国家，作为IPM(Integrated Pest Management)的重要组成部分，广泛应用于生物防治。在本研究中，我们测定了氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈对异色瓢虫的急性毒性，研究了这两种杀虫剂亚致死剂量对异色瓢虫存活率、发育历期、寿命、繁殖、体重、酶活性和基因表达谱的影响。主要研究结果如下:
　　1.急性毒性试验
　　选择异色瓢虫2龄幼虫(≤24h)用于这两种杀虫剂致死浓度和亚致死浓度测定。使用微量点滴仪向供试幼虫腹部区域点滴1μl药液，处理72h后记录急性毒性数据。结果表明:氯虫苯甲酰胺对异色瓢虫2龄幼虫的LC50值为36.67mg a.i./L，LC10和LC30值分别为2.42mg a.i./L和12.06mg a.i./L;氟啶虫胺腈对异色瓢虫2龄幼虫的LC50值为53.42mg a.i./L，LC30和LC10值分别为21.30mg a.i./L和5.65mg a.i./L。这两种杀虫剂对异色瓢虫有毒性，因为它们的LC50值均低于防控田间靶标害虫时的推荐剂量。因此，需要进一步评价这两种杀虫剂的亚致死效应。
　　2.亚致死剂量氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈下异色瓢虫生命表参数
　　选择LC30和LC10进行亚致死效应测定。采用age-stage two-sex生命表评价亚致死效应。LC10和LC30剂量下，分别取100头2龄幼虫(≤24h)进行点滴处理，点滴丙酮作为对照。处理后，记录存活率、发育历期、繁殖力和寿命，直至最后一个个体死亡。称量幼虫、蛹重、成虫体重。
　　氯虫苯甲酰胺对异色瓢虫亚致死效应。与对照相比，LC10(2.42mg a.i./L)和LC30(12.06mg a.i./L)处理后，2龄和4龄幼虫的发育历期、蛹期、产卵前期(POP)显著延长幼虫、蛹及成虫体重、成虫寿命和繁殖力显著降低。另外，异色瓢虫种群增长参数如净生殖率(R0)、内禀增长率(r)和周限增长率(λ)均显著下降。
　　氟啶虫胺腈对异色瓢虫亚致死效应。LC10(5.65mg a.i./L)和LC30(21.30mg a.i./L)处理后，处理组的发育历期、平均寿命、产卵前期(TPOP)与对照组相比均显著延长。幼虫、蛹及成虫体重、处理组成虫寿命和繁殖力均显著降低。同时，LC10和LC30对种群增长参数有不利影响，例如LC30处理组内禀增长率(r)降低到0.01d-1，其次是LC10(0.11d-1)，均显著低于对照组(0.12d-1)。氟啶虫胺腈处理组种群周限增长率(λ)和净生殖率(R0)也呈现相似趋势。
　　以上结果表明，在亚致死剂量下，氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈均对异色瓢虫至关重要的生命表参数具有不利影响，这可能导致这些天敌种群增长和捕食率的下降。异色瓢虫在杀虫剂胁迫下，必须启动体内解毒相关的过程，从而对其生物学、发育和繁殖过程产生不利影响。因此，进一步研究暴露于杀虫剂解毒酶对氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈的反应是十分必要的。
　　3.氟啶虫胺腈胁迫下解毒相关酶活性测定
　　比较异色瓢虫2龄幼虫在LC10和LC30处理处理及对照（丙酮）中，解毒相关酶如谷胱甘肽S-转移酶(GST)、细胞色素P450(P450)和羧酸酯酶(CarE)的酶活性。处理24h、48h和72h后，采集存活的幼虫用于酶活性测定。结果表明:LC10和LC30处理后，24h、48h和72h GST显著高于对照组。同样地，施药72h后，与对照组相比，处理组P450和CarE酶活性也呈增加趋势。因此可以看出，GST酶是异色瓢虫对氟啶虫胺腈解毒机制的主要解毒酶，而P450和CarE发挥部分作用。
　　4.氟啶虫胺腈诱导表达的基因
　　通过全基因组转录组测序研究异色瓢虫被氟啶虫胺腈诱导表达的基因，对深入了解该杀虫剂对异色瓢虫的作用机理是必要的。用氟啶虫胺腈LC30(21.29mg a.i./L处理异色瓢虫2龄幼虫，24h后取存活的幼虫用于转录组测序。氟啶虫胺腈处理组和对照组两个文库分别产生50，702，976和47，005，096个clean reads。这些转录产物进一步组装成52，229个unigene，其中，分别有33，820和25，175个unigene可以在NCBI非冗余蛋白质序列(Nr)和SwissProt数据库中找到同源蛋白质。在这些基因中，有794个差异表达基因，其中446个为上调基因，348个为下调基因。从DEGs中发现许多与杀虫剂相关的差异表达基因(DEG，differentially expressed genes)，如P450s、GSTs、USTs、ESTs等。此外，差异表达基因GO(the gene ontology)分析表明:处理组幼虫中大多数Go terms显著下调。此外，部分DEGs还涉及一些关键的与解毒相关的KEGG途径，如视黄醇代谢、药物代谢、异生素代谢和催乳素信号传导途径。本研究选择了15个特异性表达基因，通过实时定量PCR(qRT-PCR)分析对转录组结果进行验证。综上所述，氟啶虫胺腈可诱导异色瓢虫解毒相关基因和代谢通路的变化，为下一步研究其分子作用机制打下基础。
　　总之，本研究从不同层面证明了氯虫苯甲酰胺和氟啶虫胺腈对异色瓢虫均具有不利影响，提供了关于这两个新型杀虫剂应用对天敌潜在不利影响的全面信息:一方面，为IPM和化学防治时，如何正确选择化学农药，避免对异色瓢虫情况产生不利影响，提供了重要参考;另一方面，为进一步研究这两种新型杀虫剂对天敌的分子毒理打下了基础。

目录

论文说明

声明

Table of Contents

摘要

ABSTRACT

LIST OF ABBREVIATIONS

1．CHAPTER Ⅰ INTRODUCTION

1．1．Biological pest management

1．2．Biological control development approaches

1．2．1．Classical biological control

1．2．2．Augmentative biological control

1．2．3．Integrated pest management (IPM)

1．3．Contribution and development of pesticides

1．3．1．Chlorantraniliprole

1．3．2．Sulfoxaflor

1．4．Insecticide adverse effects on non-target arthropods

1．5．Risk assessment advancement of chlorantraniliprole and sulfoxaflor

1．6．Importance of coccinellid predator H．axyridis

1．7．Insecticide risk assessment approaches

1．7．1．Acute toxicity assessment

1．7．2．Chronic insecticide toxicity assessment

1．7．3．Biochemical induction assessment

1．7．4．Transcriptome-based toxicity assessment

1．8．Objectives of this research

2．CHAPTER Ⅱ MATERIALS AND METHODS

2．1．Insect culture development

2．2．Insecticide and acute toxicity bioassays

2．3．Sublethal toxicity bioassays

2．4．Sublethal toxicity on body weight of H．axyridis

2．5．Biochemical induction bioassays

2．5．1．Exposure to sulfoxaflor

2．5．2．Glutathione S-transferase (GST) activity

2．5．3．Cytochrome P450 activity

2．5．4．Carboxylesterases (CarEs) activity

2．6．1．Exposure to sulfoxaflor

2．6．2．RNA extraction，quantification，and qualification

2．6．3．Library preparation for Transcriptome sequencing

2．6．4．Transcriptomic data Analysis

2．6．5．Differential expression of genes analysis

2．6．6．Validation of transcriptome analysis by Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR)

2．7．Statistical analysis

3．CHAPTER Ⅲ RESULTS

3．2．Sublethal effects of insecticides on H．axyridis

3．2．1．Sublethal effects of chlorantraniliprole on H．axyridis

3．2．2．Sublethal effeets of sulfoxaflor on H．axyridis

3．2．3．Sublethal effects on pre-adult and adult body weight

3．2．4．Sublethal effects of sulfoxaflor on population growth parameters

3．2．5．Sublethal effects on survival rate，fecundity，reproduction value and life expectancy

3．2．6．Effects of sulfoxaflor on detoxification enzymes activities

3．3．Identification of genes involved in the detoxification process of sulfoxaflor in H．axyridis

3．3．1．Determination of sulfoxaflor sublethal concentration

3．3．2．Illumina sequencing and transcriptome analysis

3．3．3．Differentially genes expression under sulfoxaflor stress

3．3．4．Validation of unigenes using qRT-PCR

4．CHAPTER Ⅳ DISCUSSION

4．1．Short term insecticides toxicity

4．2．Long-term effects of insecticides on H．axyridis

4．2．1．Sublethal effects of chlorantraniliprole on H．axyridis

4．2．2．Sublethal effects of sulfoxaflor on life table parameters H．axyridis

4．2．3．Sulfoxaflor effects on body weight of H．axyridis

4．2．4．Effect of sulfoxaflor on detoxification-related enzymes

4．3．Identification of sulfoxaflor detoxification-related genes

5．CHAPTER Ⅴ CONCLUSION AND FUTURE PERSPECTIVES

REFERENCES

PUBLICATIONS

APPENDICES

ACKNOWLEDGEMENTS