拟南芥SMC5/6复合体中ASAP1-SNI1复合物的结构生物学初探

摘要

SMC5/6复合物是广泛存在于生物体中的一种蛋白复合物，研究表明SMC5/6复合物与同源重组修复，核糖体DNA及异染色质的结构维持，端粒延伸和染色质的拓扑结构调节密切相关。SMC5/6复合物由两种SMC蛋白，SMC5和SMC6，和多个Nse亚基组成。大部分生物体内只发现Nse1-Nse4这4种亚基。近年来相继在在酵母、拟南芥和人中发现了两个新的Nse亚基，Nse5和Nse6，并发现它们调控SMC5/6与DNA损伤位点的结合并进行DNA损伤修复。在拟南芥中，Nse5和Nse6的同源蛋白分别为ASAP1和SNI1。此前有研究表明SNI1是植物获得性免疫的负调控因子，能够抑制防卫基因的表达。SNI1的双重身份表明植物的免疫反应和DNA的损伤修复存在某种关联，而SNI1在其中可能发挥着十分关键的作用。为了揭示其中的分子机理，我们决定对ASAP1-SNI1复合物进行结构生物学研究。
　　本研究对ASAP1-SNI1复合物的结构生物学研究进行了初步探索:1）我们尝试在大肠杆菌中单独重组表达ASAP1和SNI1，但两者均在包涵体中且难以纯化;2）我们将SNI1与ASAP1进行共表达，成功纯化出性质良好均一的ASAP1-SNI1复合物蛋白，验证了ASAP1和SNI1的直接相互作用;3）我们对ASAPI和SNI1进行约200多种截短体蛋白筛选，确定了它们的相互作用区域，并进行约24000多个晶体条件筛选，遗憾的是暂未获得晶体。
　　本研究中虽然未能获取ASAP1-SNI1复合物的晶体，但对ASAP1-SNI1的表达条件进行了优化，并确定了ASAP1-SNI1复合物的互作区域，为后续开展ASAP1-SNI1复合物结构与功能研究提供了一定基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 SMC复合物的介绍

1．2．1 SMC复合物的发现

1．2．2 SMC复合物的组成

1．2．3 SMC复合物的分类

1．2．4 SMC5／6复合物的研究进展

1．3 Nse5-Nse6复合物的研究进展

1．4 拟南芥中Nse5，Nse6同源蛋白ASAP1，SNI1的研究进展

1．4．1 SNI1在植物系统获得性抗性中的研究进展

1．4．2 SNI1在DNA损伤修复中的研究进展

1．4．3 ASAP1的研究进展

1．5 本研究的意义

2 实验材料及方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验研究对象

2．1．2 实验所用菌株

2．1．3 实验仪器

2．1．4 实验所用载体

2．1．5 实验常用化学试剂及耗材

2．1．6 主要溶液的配方

2．2 实验方法

2．2．1 感受态制备

2．2．2 载体构建

2．2．3 蛋白的表达纯化

2．2．4 共表达验证蛋白的相互作用

2．2．5 蛋白二级结构的预测

2．2．6 限制性蛋白酶水解目的蛋白

2．2．7 半胱氨酸的突变

2．2．8 蛋白晶体的筛选及优化

3．结果及分析

3．1 ASAP1-SNI1相互作用的验证

3．1．1 克隆构建

3．1．2 ASAP1和SNI1的生物信息学分析

3．1．3 单独纯化体外孵育验证ASAP1-SNI1的相互作用

3．1．4 共表达验证ASAP1-SNI1的相互作用

3．1．5 ASAP1-SNI1复合物的质谱鉴定

3．2 ASAP1-SNI1复合物的表达优化

3．2．1 亲和标签的优化

3．2．2 ASAP1-SNI1复合物诱导条件的优化

3．3 ASAP1-SNI1复合物的晶体初筛

3．3．1 野生型ASAP1-SNI1复合物的晶体初筛

3．3．2 含半胱氨酸突变ASAP1-SNI1复合物的晶体初筛

4 讨论

4．1 总结

4．2 讨论展望

4．2．2 ASAP1-SNI1复合物互作蛋白的筛选

参考文献

附录

致谢