柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼免疫活性的研究

摘要

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）作为我国最大的淡水鱼类养殖品种，在湖北省以至全国都有很大的养殖规模，随着养殖密度和养殖规模的增加，疾病暴发在所难免。其中由柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）引起的草鱼烂鳃病是危害草鱼养殖产业的重要疾病，每年都会给草鱼的养殖业造成很大的经济损失。过去几年，使用抗菌药物防治柱形病已经导致多重耐药菌株的出现。免疫增强剂具有副作用小、可引起特定的细胞反应和预防某些特定的病原体等优点，在水产养殖中已有部分应用。相关研究表明，细菌胞外多糖(exopolysaecharides，EPS)可以增强鱼类抵抗病原感染的能力，提高其免疫应答水平，是亟待开发的新型多糖类免疫增强剂。目前开发较多的是海洋和极地微生物的胞外多糖，水产动物致病菌的胞外多糖因其特殊的免疫原性，有望成为新型的免疫增强剂。因此，本研究以草鱼为研究对象，探究柱状黄杆菌的EPS作为免疫增强剂对草鱼免疫功能的影响。主要的研究结果如下:
　　1.柱状黄杆菌EPS的制备。用本实验室前期从黄颡鱼病鱼上分离的一株柱状黄杆菌Pf1，发酵培养得到含大量胞外多糖的上清液，经三氯乙酸除蛋白、乙醇反复沉淀、蒸馏水透析、PEG20000浓缩后得到纯度较高的EPS。用苯酚硫酸法测得EPS的浓度为1.2mg/mL。
　　2.EPS对草鱼血清酶及免疫保护率的影响研究。采用酶标仪检测草鱼血清中酶的活力，注射EPS的草鱼与对照组相比，用柱状黄杆菌浸泡感染前，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性显著降低，细菌感染后，AKP酶活性显著升高，并在第4天时，酶活性最大;实验组在感染的第2d，超氧化物歧化酶(Super oxide Dismutase，SOD)活性显著高于对照组，达到最大;草鱼注射0.2mg EPS一周后，与对照组相比，在浸泡感染柱状黄杆菌的第14d，注射EPS的草鱼存活率为85％，远高于对照组的55％，草鱼的免疫保护率为67％。该结果表明，柱状黄杆菌产生的EPS可作为免疫增强剂使用。
　　3.EPS对草鱼免疫相关基因影响的研究。实时荧光定量PCR检测结果表明，草鱼注射0.2mg EPS一周后，与对照组相比，在浸泡感染柱状黄杆菌的第4d，在肝脏、脾脏、头肾中，注射组的白介素1(IL-1)、组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达水平显著提高;短链五聚素(PTX)在草鱼的肝脏中，表达无显著差异;在感染第4d，PTX在脾和头肾中的表达量显著提高;四个基因在体肾的表达变化呈现不同的规律。该结果表明，柱状黄杆菌产生的EPS可以加强机体的炎症反应、体液免疫和抗原提呈能力。
　　结果表明:柱状黄杆菌的EPS能够增强草鱼对柱状黄杆菌的抵抗力，提高草鱼的免疫应答水平。EPS注射后的草鱼，在柱状黄杆菌感染时可产生和分泌更多的AKP、SOD。EPS可以使IL-1、MHCⅠ、PTX和TNF-α等免疫相关基因表达量升高，增强草鱼的免疫功能，显著提高草鱼的存活率。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 柱状黄杆菌的研究进展

1．1．1 柱状黄杆菌的历史及生物学特性

1．1．2 柱状黄杆菌引起鱼类的患病症状

1．1．3 柱状黄杆菌的毒力因子

1．1．4 柱状黄杆菌及其组分的免疫原性

1．1．5 柱形病的防治

1．2 胞外多糖的研究进展

1．2．1 胞外多糖的研究概况

1．2．2 细菌胞外多糖的生理功能

1．2．3 胞外多糖对鱼类的免疫调节作用

1．3 研究目的与意义

2 柱状黄杆菌胞外多糖的制备

2．1 实验材料

2．1．1 细菌

2．1．2 实验试剂

2．1．3 试剂的配制

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 柱状黄杆菌胞外多糖的诱导

2．2．2 柱状黄杆菌胞外多糖的提取

2．2．3 苯酚硫酸法测定柱状黄杆菌胞外多糖浓度

2．3 实验结果

2．3．1 苯酚硫酸法测定柱状黄杆菌胞外多糖浓度

2．4 分析讨论

3 柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼抗病性的影响

3．1 实验材料

3．1．1 细菌、胞外多糖与草鱼

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 胞外多糖对柱状黄杆菌攻毒的草鱼血清AKP和SOD的影响

3．2．2 胞外多糖对柱状黄杆菌攻毒的草鱼死亡率的影响

3．2．3 统计学方法

3．3 实验结果

3．3．1 胞外多糖对柱状黄杆菌攻毒的草鱼血清AKP的影响

3．3．2 胞外多糖对柱状黄杆菌攻毒的草鱼血清SOD的影响

3．3．3 胞外多糖对感染柱状黄杆菌草鱼的免疫保护率的影响

3．4 分析讨论

4 柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼相关免疫相关基因的影响

4．1 实验材料

4．1．1 细菌、胞外多糖与草鱼

4．1．2 引物序列

4．1．3 实验试剂

4．1．4 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 草鱼的免疫刺激

4．2．2 RNA的提取

4．2．3 cDNA的合成

4．2．4 荧光定量PCR

4．3 实验结果

4．3．1 IL-1 mRNA在各组织中的表达

4．3．2 MHC Ⅰ mRNA在各组织中的表达

4．3．3 PTX mRNA在各组织中的表达

4．3．4 TNF-α mRNA在各组织中的表达

4．4 分析讨论

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

附录

致谢