丁香假单胞菌铁载体PYOVERDINE介导的杀秀丽隐杆线虫活性与铁在致病性中的作用

摘要

丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）是一种已被深入研究的革兰氏阴性植物病原细菌，但该菌对动物如秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的致病性最近也已被研究证实。铁是自然环境中最丰富的元素之一，但其生物利用率一直相对较低。多种不同的微生物类群已经发展出具有对铁具有高亲和性能的铁吸收系统，包括血红素摄取系统、铁载体系统和细胞膜受体等。假单胞菌属（Pseudomonas）的主要铁载体是pyoverdine。它是一种低分子量、高亲和力的铁清除荧光分子，仅在铁限制条件下由荧光假单胞细菌群产生。除了具有对铁的吸收性能，铁载体pyoverdine也可以作为细菌毒素。本学位论文主要研究了基于液体培养条件下的线虫致病模型中，在铁限制条件下丁香假单胞菌野生菌株MB03和秀丽隐杆线虫之间的相互作用，以及铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌致病性中的作用。
　　鉴于铜绿色假单胞菌（Pseudomonas aerugionosa）PAO1菌株已经鉴定出几乎所有与pyoverdine生物合成和分泌相关的基因，使用PAO1菌株的pyoverdin基因簇作为参考序列，利用在线工具Anti-SMASH对丁香假单胞菌MB03基因组中pyoverdine编码基因簇进行了预测和定位分析。结果发现，发现丁香假单胞菌MB03中缺少5个与PAO1中的直系统同源基因(pvdX,pvdY,pvdA，pvdF和fpvI)。在这些基因中，pvdX和pvdY编码调节蛋白;pvdA和pvdF编码合成N5-甲酰基-N5羟基鸟氨酸残基所需的酶，这些残基存在于PAO1的pyoverdine的肽链中。但在MB03的pyoverdine基因簇中也存在一种为PAO1中所没有的基因，即syrP。推测syrP的编码产物可能参与存在于MB03-PVD肽链中的羟基天冬氨酸残基的β-羟基化作用此外，在PAO1中，两个Sigma因子编码基因pvdS和fpvI分别参与pyoverdine生物合成和pyoverdine受体FpvA的激活，但是，在丁香假单胞菌MB03的基因组中不存在fpvI,而是在fpvA基因的前面有一个pvdS IS基因框，表明在丁香假单胞菌MB03中的pvdS可能参与fpvA基因的转录。
　　Pyoverdine在结构上由3个不同的结构域组成，即生色团（最保守的部分）、肽链（最可变部分）和侧链（羧酸衍生物）。在MB03的铁载体pyoverdine基因簇中的非核糖体基的多肽合成酶(NRPS)基因编码参与pyoverdine的肽链和发色团部分合成的一种大分子量酶。通过NRPS预测因子对丁香假单胞菌MB03的5个推定的NRPS基因进行计算机模拟表征表明，MB03-PVD的肽链呈线性形式并且由L-1ys，D-Asp，L-Thr，L-Thr，L-Ser，D-Asp和L-Ser。经测定铁载体pyoverdine特定光吸收值，发现MB03产生的pyoverdine与培养基中的Fe3+浓度成反比，而铁对于pyovidine生产的临界抑制浓度约为20μmol/L。
　　通过使用RecTE重组系统来进行pyoverdine生物合成2个相关基因的中断，获得了相应基因中断突变株ΔpvdD和ΔpvdJ。由于pyoverdine是一种分泌的非核糖体多肽，所以可通过LC-MS和荧光光吸收测定来鉴定中断菌株是否丧失产铁载体pyoverdine的活性。结果发现，两株突变株的破碎细胞滤液均缺乏pyoverdine特征性的黄绿色荧光，表明突变株未能产生pyoverdine。经质谱鉴定，2株突变株也缺乏pyovine的特征峰，而野生型MB03产生了具有1123.412m/z和1142.4165m/z的两类pyovidine。
　　为调查铁在MB03对线虫致病性中的作用，在添加或不添加铁的M9培养基中来培养MB03菌株，然后进行对秀丽隐杆线虫的杀虫生物测定。由于Pyoverdine也有助于在丁香假单胞菌中发现的几种常见致病因子(如AHL，EPS和Tabtoxin)的产生，因此，pyoverdine有可能在培养过程中由于铁在培养基浓度的不同从而调节了细胞毒性、并导致对线虫杀虫效果的差异性。为验证这一假设，将过夜MB03培养物产生的滤液分成两半，其中之一添加额外的100μmol/L铁并培养过夜。生物测定结果发现，野生菌株MB03导致供测线虫的显著性致死(p=0)，但通过在M9中添加外源铁（100μmol/L）或通过在MB03过夜培养物中直接添加外源铁的细胞滤液可在一定程度上减小致死率。此外，液相生物测定的致死效应通常发生在培养30h之后，因此，足够的培养时间对于细菌的致死作用也是进行生物测定时要考虑的。
　　将基因中断突变株ΔpvdD和ΔvdJ与野生菌株MB03在贫铁的M9培养基中生长后进行液相杀虫生物测定，另外，使用纯化铁载体pyoverdine进行相应生物测定，因为推测pyoverdine可能是具有杀虫活性的MB03滤液中的一种作用导致线虫死亡的活性因子。在液相生物测定中使用的纯化pyoverdine的浓度与在MB9中在48h内在M9培养基中产生的pyoverdine的浓度相当。测量暴露于各种滤液的线虫的相对死亡率，结果如预期相符:与M9和大肠杆菌（Escherichia coli OP50滤液相比，MB03滤液显示显着的杀死作用(p=0)，而两种突变株的杀虫试验都没有发现线虫死亡。
　　为了证实突变体的减毒活性是由于缺乏pyoverdine产生的，将纯化的pyoverdine加入突变体中以测量与野生型相当的相对死亡率，结果证实pyoverdine是导致线虫死亡的细菌滤液中的活性因子。通过pyoverdine生物合成缺陷的突变株的减毒活性、以及两突变株在添加纯化的pyoverdine后又可杀线虫的实验结果可以证实，pyoverdine在MB03介导的液相杀虫实验中是决定杀虫活性的重要因素。此外，通过测量MB03和两种突变株的生长曲线，发现突变株在贫铁M9培养基中生长缓慢。因此，这表明pyoverdine对丁香假单胞菌MB03生长也是至关重要的。
　　总之，本研究结果表明，丁香假单胞菌MB03具有产生pyoverdine的遗传潜力。通过RecTE重组系统构建获得2株pyoverdine生物合成缺陷的基因中断突变株。铁载体pyoverdine在MB03菌株对秀丽线虫的杀虫活性中发挥重要作用。同时，pyoverdine也是影响宿主细胞生长的重要因素。就我们所知，本项研究是研究丁香假单胞菌铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌与动物宿主之间相互作用的第一例研究。

目录

DECLARATION LETTER

声明

Table of contents

摘要

ABSTRACT

List of Abbreviations

1 Literature review

1．1 Genus Pseudomonas

1．1．1 Pseudomonas syringae

1．2 Importance of iron to life

1．2．1 Problems with iron

1．2．2 Iron uptake system of Gram-negative bacteria

1．3 Siderophores

1．3．1 Types of siderophores

1．3．2 Siderophores of Pseudomonas species

1．3．3 Pyoverdine

1．3．4 Global pathway of a pyoverdine from biosynthesis to secretion in P．aeruginosa

1．4 Host range of some species of Genus Pseudomonas

1．5 Caenorhabditis elegans

1．5．3 Survival assays using C．elegans

1．5．4 Role of pyoverdine in virulence of bacteria

2 Aims and significance of this study

3 Material and Methods

3．1 Experimental Design

3．2 Bacterial and C．elegans strains，Genes and Plasmids

3．3 Apparatus and equipment

3．4 Chemicals，Media and Growth Conditions

3．5 Preparation of Bacterial Culture

3．5．1 Revival of Bacterial Culture

3．5．2 Preparation of overnight Bacterial culture

3．7 Pyoverdine determination assay

3．8 Molecular Biology Techniques

3．8．1 Polymerase chain reaction (PCR)

3．8．2 Agarose gel electrophoresis

3．8．3 Purification of DNA

3．8．4 Plasmid Extraction

3．8．5 Preparation of electro-competent cells of P．syringae MB03

3．8．7 Disruption of pyoverdine biosynthetic genes by RecTE recombination system

3．9 LC-MS analysis of cell filtrates of MB03 and its derivatives

3．10 C．elegans Special Techniques

3．10．2 Synchronization of C．elegans

3．10．3 Liquid Killing Assay

4 Results

4．1．P．syringae MB03 has Genetic PotentiaI to Produce Pyoverdine

4．2．Pyoverdine is produced by P．syringae MB03 only under iron1imitil conditions limiting conditions

4．3．Genetic，Biochemical and Spectrofluorometric Analysis of Pyoverdine NRPS Genes pvdD and pvdJ

4．4 Pyoverdine Exposure Causes C．elegans Death

4．5 Role of Iron in the Pathogenicity of MB03 against C．elegans

5 Discussion

6 Concluding remarks and Future Prospects

References

List of Publications

Extra Achievements during my Master’s

Appendix

Acknowledgements