神经营养素-3基因修饰的神经干细胞对周围神经再生修复的作用

摘要

周围神经损伤的修复一直是医学界感到十分棘手的问题.该试验采用的是二步法,首先我们获取14-15天SD胚鼠大脑皮质,采用含bFGF的诱导生长培养基,获得原代的神经干细胞球,进行Nestin免疫组化鉴定,然后通过5溴-2脱氧尿苷(BrdU)掺和试验了解该细胞的自我增殖能力.再将次代细胞球置于含血清的分化培养基,免疫细胞化学技术观察并鉴定它的分化能力.在第二部分,我们采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒表达载体pAd-NT-3转染原代培养的神经干细胞,观察GFP及NT-3两种蛋白的表达,镜下测定转染率,采用免疫组化和逆转录酶-多聚酶链反应(RT-PCR)方法进行鉴定,并对RT-PCR产物测序,进一步证实NT-3的存在.转染后的神经干细胞经G41 8筛选,获得成功转染NT-3基因的NSCs克隆.结果镜下观察到绿色荧光蛋白长期表达在转染后的神经干细胞,转染率可达40％.免疫组化和RT-PCR结果显示NT-3在神经干细胞表达,并可以长期表达.测序结果与Genbank相-致.说明神经营养素-3基因,通过腺病毒的介导,以阳离子脂质体为载体,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达.最后,为了探讨神经营养素-3基因修饰的神经干细胞对周围神经再生修复的影响,从转基因角度探讨治疗周围神经损伤的有效方法,我们选用54只SD大鼠随机分为3组,造成坐骨神经切断损伤模型,神经外膜端端对位缝合后,于小腿三头肌每周分别注射生理盐水、未被神经营养素-3基因修饰的神经干细胞、及神经营养素-3基因修饰的神经干细胞.术后3w、6w、9w动态观察坐骨神经功能指数(SFI)以了解后肢功能恢复情况、测量吻合口处各组动物神经横切片上的轴突数目、组织学切片观察、肌湿重恢复率测定、并行吻合口神经干的电镜观察.

目录

前言

第一部分：SD胚鼠神经干细胞的培养与鉴定

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分：神经营养素-3基因修饰神经干细胞

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第三部分：神经营养素-3基因修饰的神经干细胞对周围神经再生修复的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

综述周围神经损伤的基因治疗

一周围神经损伤与神经营养因子

二周围神经损伤与基因治疗

三基因治疗的前景

参考文献

致谢