诱导前软骨干细胞向成软骨方向定向分化的机制及其体内构建骺板的研究

摘要

研究目的 建立PSC<,s>的分离纯化方法及PSC<,s>细胞库,探讨TGFβ(transforming growth factorβ)诱导PSC<,s>向成软骨方向定向分化的可行性及特异性软骨细胞外基质的表达机制;评价增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因修饰PSC<,s>的效果及其与骨基质明胶(BMG)复合物异位移植的成软骨能力;探讨藻酸盐水凝胶(alginate hydrogel,AH)与PSC<,s>复合物体内构建骺板样组织的可行性.研究方法 利用磁性细胞分选术分离纯化有FGFR-3表面标志的骨骺PSC<,s>,用流式细胞术(FACS)、免疫组化、免疫荧光等技术鉴定纯化后的PSC<,s>.将PSC<,s>体外扩增至第3代,采用液氮深低温保存细胞,应用RT-PCR、免疫组化免疫荧光等技术定期对复苏PSC<,s>行生物学特性鉴定.采用藻酸盐凝胶培养,分别以TGFβ3诱导分离纯化的PSC<,s>向成软骨方向分化,应用免疫组化、RT-PCR、免疫沉淀、western blot和分光光度等技术测定PSC<,s>向成软骨方向分化过程中特异性软骨细胞外基质成分的表达.用脂质体介导法将EGFP基因表达载体pEGFP转染PSC<,s>,G418筛选得到EGFP基因修饰PSC<,s>,将EGFP基因修饰PSC<,s>与BMG复合体体外培养后植入大鼠体内,荧光显微镜下定期观察复合体GFP表达,免疫组化检测Ⅱ型胶原表达.用多聚赖氨酸和藻酸盐制备AH,将PSC<,s>在含有TGF-β3的藻酸盐微珠中培养,分别于7、14、21d将被诱导的PSC<,s>包埋入AH制备成AH-PSC<,s>复合物;分别将AH-PSC<,s>自体植入大鼠背部肌肉中,定期取材测定移植物的重量、细胞数,并行组织学检查及Ⅱ型胶原免疫组化检测.研究结论 磁性细胞分选术可有效地分离纯化PSC<,s>.可用液氮深低温保存的方法建立新生大鼠PSC<,s>细胞库.TGFβ能诱导PSC<,s>向成软骨方向定向分化,此分化过程伴随特异性软骨细胞外基质成分的沉积.EGFP基因修饰PSC<,s>在体外能长期稳定表达GFP,EGFP基因修饰PSC<,s>与BMG共移植时可形成软骨组织及骨组织,但无骺板样结构.TGF-β3诱导PSC<,s>7d的AH-PSC<,s>复合物在体内能构建骺板样组织,可望成为修复骺板组织的有效方法.

目录

主要缩略词和术语

前言

第一部分 骨骺前软骨干细胞的分离纯化及鉴定

摘要

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分 骨骺前软骨干细胞库的建立

摘要

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第三部分 TGF-β诱导前软骨干细胞向成软骨方向定向分化

摘要

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第四部分 增强型绿色荧光蛋白基因修饰前软骨干细胞及其与骨基质明胶复合物异位成软骨作用

摘要

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第五部分藻酸盐水凝胶与前软骨干细胞复合物体内构建骺板样组织

摘要

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

小结

综述

综述一间充质干细胞在软骨组织工程中的研究进展

综述二骨骺组织工程研究进展

近年发表的文章及参编的著作

致谢