侧耳属白腐菌漆酶分泌特性研究

摘要

漆酶（Laccase，EC1.10.3.1）是白腐菌降解木质素酶系中的重要酶之一，具有高氧化还原电位、不需要H2O2启动而以O2为电子受体，因而具有比其他几种木质素酶更实际的应用价值。侧耳属白腐菌是白腐菌中重要的一类，具有较高的漆酶分泌能力。 论文首先从液体和固体两种培养体系出发，探索不同培养条件对白腐菌分泌漆酶的影响。液体培养体系下，白腐菌的最佳生长和漆酶分泌条件是非缓冲体系起始pH5.0、摇瓶转速为150rpm、装液量为150mL/250mL；最佳诱导中间产物为玉米秸秆固体降解液，漆酶活力最高达3,748U/mL，是未加中间产物的10倍以上。菌株漆酶活力固体培养体系下明显高于液体培养体系下，最高达4,592U/mL；菌株在纯木屑固体培养下比在其他几种固体基质培养下有更高的漆酶分泌能力，漆酶分泌的多峰现象更明显，但菌株生长较差。液、固体两种培养体系下，将木质纤维素基质或结构类似中间产物引入白腐菌降解染料的体系中均可实现两者的共代谢。 以固体基质培养为研究对象，研究白腐菌生长动力学、分泌漆酶动力学和降解木质纤维素特性，对菌株同工酶分泌、酶的分离纯化和主要酶学性质进行研究。发现该菌株漆酶分泌出现多峰现象的主要原因是存在多种同工酶，主要有低分子量漆酶Lac1和中高分子量漆酶Lac2和Lac3。酶活的高低与同工酶之Lac1有密切的关系，Lac1酶谱带颜色越深、越长，漆酶酶活就越高，Lac2和Lac3只起辅助作用。对Lac1的酶学性质进行研究，其分子量为33.8kDa；最适反应pH为5.0，pH6.0左右稳定性最高；最适温度为25℃，25℃稳定性最高；Cl-1对漆酶活力抑制强烈，Cu2+和Co2+具有明显的激活作用；以ABTS为底物时，培养6d时Lac1在木屑、玉米秆和稻草秆三种固体基质上的动力学参数米氏常数Km分别为0.037727、0.035377和0.032165 mmol/L，粗漆酶对应的Kmˊ分别为0.016894、0.024293和0.024024 mmol/L，表明粗漆酶对于底物有更高的亲和力，漆酶同工酶作用底物具有协同效应；检测Lac1对四种染料的脱色效果，其对孔雀绿的脱色效果最明显，作用12h，脱色率达51.0﹪。 菌株生长、分泌漆酶动力学和降解木质纤维素之间有一定的关联和前后一致性。基质木质化程度影响漆酶分泌，木质化程度越高，越有利于诱导漆酶分泌，FTIR图谱中化学键氧化断裂峰形变化越明显，木质素的降解量和选择性也越高；而纤维素和半纤维素含量越高，越有利于菌株的生长。 本论文首次对白腐菌分泌漆酶过程中存在的多峰现象、米氏常数Km随时间变化很大等现象做了合理的解释和初步的研究；首次对白腐菌的生长、分泌酶系、降解木质纤维素之间的关系做了一定的探讨。