靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响及增强丝裂霉素敏感性的实验研究

摘要

研究背景：以手术为主的综合治疗是目前处理原发性肝癌的主要模式。化疗和化疗相关治疗在肝癌的综合性治疗中发挥重要的作用。药物耐受是影响肝癌综合治疗的重要因素。肝癌细胞中相关基因的异常表达所致细胞凋亡障碍是药物耐受的原因之一。Survivin基因是凋亡抑制蛋白家族成员之一，其异常表达与肿瘤的发生、发展和药物耐受密切相关，但其在化疗药物所致肝癌细胞耐受过程中的作用目前国内外研究较少。采取有效措施抑制肿瘤细胞内凋亡抑制基因的表达并增强相关药物的作用是目前研究的热点。RNA干扰是生物体保持其自身遗传性状的稳定和调控后生型突变的一种生理现象。作为一种古老的保护机制，RNAi不仅可以抵御外源有害基因入侵，而且将其作为一种解读基因功能的研究技术还可能为功能基因组学、基因治疗学等众多领域带来新的突破。目前RNA干扰在理论上有望成为一种新的肿瘤基因治疗方案。运用RNA干扰技术抑制肝癌细胞中异常表达的Survivin基因并增强化疗药物的敏感性可能为肝癌的治疗带来新的思路。 目的：通过测定丝裂霉素作用肝癌细胞过程中Survivin的表达变化探明肝癌细胞可能的耐药机理。构建靶向survivin的真核表达载体，经稳定转染肝癌细胞并建立细胞系后观察其对肝癌细胞生物学行为的影响及增强丝裂霉素对肝癌细胞作用的可能性。 方法：在培养的肝癌细胞株HepG2中加入低浓度丝裂霉素，于不同时间点收集细胞后运用RT-PCR以及免疫印迹法检测survivinmRNA及蛋白质的表达变化。根据RNA干扰的设计原则设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列，中间间隔9个核苷酸序列，通过定向克隆至载体PSilencer2.1，构建siRNA真核表达载体。核酸测序方法鉴定构建质粒的正确性。应用RT-PCR及流式细胞技术检测siRNA对肝癌细胞中survivinmRNA及蛋白质表达的抑制情况。将此siRNA真核表达质粒稳定转染HepG2细胞并建立细胞系。以此细胞系为研究平台，通过台盼蓝染色对肝癌细胞的生长进行分析，通过细胞凋亡—Hoechst染色观察肝癌细胞的凋亡形态，应用流式细胞技术计算凋亡率。进行裸鼠异体肿瘤接种实验，观察肿瘤的生长状况并测量计算肿瘤的体积，绘制肿瘤生长曲线并计算成瘤率。继续以此细胞系为研究平台，以MTT法检测化疗药物丝裂霉素作用的敏感性。以免疫印迹法检测丝裂霉素作用于不同细胞、不同时间点下Survivin蛋白的表达情况。采用细胞凋亡检测试剂盒及Caspase活性检测试剂盒对丝裂霉素作用于不同细胞、不同时间点下凋亡率及Caspase-3活性进行检测。 结果：肝癌细胞株加入丝裂霉素12h未见survivin明显表达改变，24、48h后可检测到survivinmRNA表达较加药前分别增加1.30、1.69倍，蛋白质表达增加1.18、1.28倍，均有显著差异。核酸测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT-PCR及流式细胞术检测，siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达73％和75％。转染细胞生长速度明显减慢，凋亡率增加2.68倍。裸鼠体内成瘤率下降75％，9～30d肿瘤体积与对照组相比差异显著。MTT法观测到当survivin的表达被有效抑制后，肝癌细胞在丝裂霉素作用下12h的存活率即出现明显抑制，并且在48h时达到高峰。免疫印迹法检测显示未加丝裂霉素之前survivin蛋白的表达和加入丝裂霉素后的表达存在差异。流式技术及Caspase活性检测显示各时间点阳性对照组凋亡率及活性增加。 结论：丝裂霉素诱导肝癌细胞Survivin表达升高具有时间效应，Survivin表达升高可能在肝癌细胞耐药过程中发挥了一定作用。靶向survivin的siRNA能特异性下调目的基因的表达并能在体内体外抑制肝癌细胞株的生长。另外其还可增强化疗药物丝裂霉素对肝癌细胞作用的敏感性。

目录

前 言

实验流程

第一部分丝裂霉素诱导肝癌细胞survivin基因表达的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分靶向survivin的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

前言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响

前言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第四部分 靶向survivin的siRNA诱导肝癌细胞化疗敏感性的实验研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

研究小结

综述：RNA干扰的研究进展

前言

1.RNA干扰的发现及命名

2.RNAi的作用机制

5.RNAi在哺乳动物中的实现策略

6.前景与展望

参考文献

附录:科研论文

致谢