菝葜提取工艺的改进及药理学研究

摘要

菝葜(SmilaxchinaL)又名金刚藤，是百合科菝葜属的一种多年生落叶攀援灌木，药用其根茎。目前临床上主要用于妇科盆腔炎等疾病的治疗，有较好疗效。目前的菝葜制剂主要为40﹪乙醇提取物制成的糖浆、胶囊剂等，采用的仍是水煮醇沉工艺，活性成分难以得到保证，有效成分较低、服用量大，同时对有效作用部位及治疗盆腔炎等疾病的相关药理学没有进行过较系统全面的研究，影响了其在临床上的进一步推广应用。本文通过膜分离技术对菝葜原有提取工艺进行改进，以两种黄酮和薯蓣皂苷为质量控制指标，建立了HPLC含量测定方法，同时结合其主治病症盆腔炎、慢性盆腔炎等疾病相关药理学模型，如抗炎、镇痛、免疫抑制、抗菌等，对其治疗及机理进行了探讨，研究结果给菝葜的临床用药及进一步开发利用提供了理论及实验依据。本文完成的主要工作如下：1.改进了菝葜提取物制备工艺并对其中的薯蓣皂甙元、山柰酚和槲皮素进行了HPLC定量分析通过膜分离技术对菝葜原有生产工艺进行了改进，并对其有效成分进行了测定。用纯甲醇为流动相在室温（25℃）和流速为1ml·min-1时测得薯蓣皂甙元的保留时间为12.35min左右；用水-乙腈-磷酸-三乙胺（65:35:0.27:0.45）作为流动相，流速0.7ml·min-1和在室温（25℃）时测得山柰酚和槲皮素的保留时间分别为24.32min和13.94min左右；且薯蓣皂甙元和山柰酚主峰与相邻杂峰分离度均大于2，达到了色谱分离的要求，槲皮素主峰也与相邻杂峰获得了较好的分离效果。HPLC分析表明水提醇沉提取物、膜分离物和乙酸乙酯提取物中薯蓣皂苷元、槲皮素和山柰酚含量依次为0.0183﹪，0.0299﹪和0.1446﹪；0.0102﹪，0.0164﹪和0.1836﹪；0.0076﹪，0.0093﹪和0.1232﹪。该方法精密度和重现性均较好。同时表明了膜分离工艺代替传统工艺提纯金刚藤有效成分、去除杂质是可行的。2.菝葜不同提取物的抗炎作用研究采用蛋清致足肿胀、甲醛致足肿胀、二甲苯致耳肿胀和醋酸致腹膜炎模型对菝葜不同提取物对急性、早期炎症的抗炎作用进行了研究，结果表明：在100g·生药/kg剂量下，各提取物能显著降低蛋清诱导的大鼠足跖肿胀程度，活性大小依次为乙酸乙酯提取物>膜分离物>水提物；此外，还能明显抑制甲醛诱导的小鼠足肿胀程度、小鼠腹腔毛细血管通透性增高和二甲苯诱导的耳廓肿胀，活性依次为水提物>乙酸乙酯提取物>膜分离物，但三种提取物间差异并不显著；皮下植入琼脂致小鼠肉芽肿形成模型研究结果也表明菝葜提取物对炎症晚期（慢性炎症）也有一定的抑制作用，活性大小依次为乙酸乙酯提取物>膜分离物>水提物。通过大鼠血小板和腹腔巨噬细胞培养实验对菝葜的抗炎机理进行了探讨，研究了菝葜不同提取物(1-100mg·ml-1)对sPLA2活性，NO、TXB2和PGE2合成/释放的影响，各提取物能明显抑制NO的合成、释放及sPLA2、COX1和COX2酶活性，抑制活性大小依次为乙酸乙酯提取物、膜分离物和水提物。提示其抗炎活性机理可能是通过抑制花生四烯酸代谢的多个环节及NO的合成、释放，大大降低炎症部位的炎性介质而发挥抗炎作用。各提取物对蛋清致炎及炎性介质的抑制作用随着提取物中薯蓣皂苷元、槲皮素和山柰酚含量增大而增强。3.菝葜不同提取物的免疫调节作用研究用细胞免疫相关动物模型及淋巴细胞体外培养实验研究了菝葜对细胞免疫和体液免疫功能的影响，各提取物(50-100g.生药/kg)不同程度地影响小鼠脾脏和胸腺重量，显著抑制小鼠DTH；一定程度地抑制体液免疫，其中均以膜分离物抑制效果较好；1-100mg·ml-1剂量明显抑制大鼠B、T细胞的增殖（高剂量乙酸乙酯提取物例外）；结果表明对细胞免疫及体液免疫均有一定程度的抑制作用。大鼠腹腔巨噬细胞体外培养实验结果表明菝葜各提取物能显著增强其吞噬能力，其机理主要是提高LDH活性而提供更充分的能量，同时提高溶菌酶和ACP活性而增强其对病菌的分解破坏能力。(100mg·ml-1)高剂量作用时巨噬细胞吞噬能力及各酶活性随提取物中薯蓣皂苷元、槲皮素和山柰酚含量增大而显著提高。4.菝葜不同提取物的抗菌作用研究三种提取物对实验中的各种革兰氏阳性菌都有较好的抑制作用，并随着提取物中薯蓣皂苷元、槲皮素和山柰酚含量增大而增强；除了对大肠杆菌、奴卡氏菌和新生隐球菌有一定程度抗菌作用外，对实验中的其它各种革兰氏阴性菌及真菌则几乎没有什么抑制作用。膜分离物具有比水提物更强的抗菌活性。微量热法实验表明：在药物作用下，大肠杆菌生长停滞期延长，生长峰明显后移，生长期的最大发热功率显著减小，在60μg/ml浓度以下影响较小，但随浓度的增大，变化更趋明显，表明不同提取物对大肠杆菌具有较明显抗菌活性。5.菝葜不同提取物的镇痛作用研究用多种动物模型及肥大细胞体外培养实验研究了菝葜的镇痛作用和可能机理，结果表明菝葜不同提取物不仅能明显提高小鼠热致痛痛阈；还能明显降低腹腔注射醋酸引起小鼠产生扭体反应的扭体次数及足注射甲醛引起小鼠足红肿疼痛所致的舔足或抬足次数，对小鼠不同部位的热及化学物质致痛均具有较明显的镇痛作用，并表现出一定的剂量依赖效应。三种提取物间差异并不显著。各提取物10μg·ml-1以上剂量不仅能极显著抑制肥大细胞组胺的合成/释放，还能明显抑制肥大细胞的合成/释放。高剂量(100μg·ml-1)时对甲醛致痛及肥大细胞合成/释放组胺和5-HT的抑制作用随提取物中薯蓣皂苷元、槲皮素和山柰酚含量增大而增强。