大蒜新素对HCMV即刻早期、早期和晚期基因转录水平影响的研究

摘要

【目的】研究大蒜新素对HCMV即刻早期(ie)、早期(e)和晚期(l)基因转录水平的影响，以探讨大蒜新素抗巨细胞病毒效应的作用机制。 【方法】选择病毒增殖周期中最主要的ie基因u1122和u1123(分别编码IE86和IE72)、标志性e基因u154(编码UL54)和标志性l基因u183(编码pp65)为靶序列设计特异性引物和taqman探针，并用GAPDH为管家基因校准样本细胞数，建立定量检测HCMVul122、ul123、u154和u183mRNA的实时定量PCR系统。实验分组为：①大蒜新素(9.6μg/ml)处理AD169株(MOI=2.5)感染细胞组；②AD169株(MOI=2.5)感染细胞对照组；③大蒜新素(9.6μg/ml)处理HCMVIE72缺陷株(△IE72株，其主要即刻早期基因编码区外显子4缺失而不能表达IE72，MOI=2.5)感染细胞组；④HCMVIE72缺陷株(MOI=2.5)感染细胞对照组。用所建立的实时定量PCR系统检测各组细胞在感染后0.5、2、4、6、12和24h病毒u1122、u1123、u154和u183mRNA水平的动态变化。 【结果】1.定量检测u1123mRNA：AD169株u1123mRNA于感染后0.5h开始表达，在感染后0.5h～4h时段迅速升高，然后进入平台期(4h～12h)，以后略有升高，而△IE72株感染细胞未检测到u1123mRNA。大蒜新素处理AD169株感染细胞组u1123mRNA表达量在各时段均显著低于AD169株感染细胞对照组(P＜0.01)，药物对AD169u1123mRNA抑制率在感染后24h最高，达59.4％。 2.定量检测u1122mRNA：AD169株和△IE72株感染的u1122mRNA表达规律相似，于感染后0.5h开始表达，感染后0.5h～4hmRNA表达量升高迅速，然后进入平台期(4h～12h)，以后略有升高。大蒜新素在感染后各时段均显著抑制AD169和△IE72株感染细胞u1122mRNA表达(P＜0.01)，其抑制率于感染后24h最高，分别达69.3％和82.3％。 3.定量检测u154mRNA：AD169株感染细胞u154mRNA于感染2h后表达逐渐增多，4h～24h时段表达量明显持续增加；而△IE72株感染细胞在感染2h后u154mRNA水平逐渐缓慢升高，增幅明显低于AD169株感染细胞。大蒜新素在感染后4h～24h时段明显抑制AD169和△IE72株感染细胞u154mRNA表达(P＜0.05和P＜0.01)，其抑制率在感染后24h最高，分别为39.8％和52.9％。 4.定量检测u183mRNA：两种病毒感染细胞在感染6h后开始表达u183mRNA，其水平迅速增多，以AD169感染变化显著。大蒜新素明显抑制AD169和△IE72株感染细胞u183mRNA表达，在感染后24h抑制率分别为36.8％和40.2％。 【结论】1.大蒜新素明显抑制HCMVAD169株ie基因(u1123和u1122)转录，抑制率高达59.4％和69.3％，对e基因(u154)和l基因(u183)转录的抑制率仅为39.8％和36.8％，提示病毒ie基因可能是药物的主要作用环节。 2.IE72缺失对u1122mRNA表达无明显影响，但可导致u154mRNA表达量显著减少和u183mRNA表达减少，提示虽然在高MOI感染时，IE72缺陷株可以感染靶细胞并可复制增殖，但病毒下游基因转录仍因IE72缺失而受到影响。

目录

前 言

一HCMVAD169毒株和IE72缺陷毒株制备及感染性滴度测定

二建立检测HCMV ul122、ul123、ul54和ul83mRNA的实时定量PCR系统

材料和方法

结果

讨论

参考文献

三实时定量PCR法检测大蒜新素对HCMVul122、ul123、ul54和ul83mRNA表达的影响

小结

参考文献

附一 实时定量PCR技术与短时培养法检测尿样本HCMV的比较

附二 一步法RT-PCR检测鼻病毒基因及扩增产物测序分析

综 述 儿科病毒感染性疾病和抗病毒治疗

研究生期间参与的课题和研究生期间发表的论文

致 谢