罗格列酮（BRL49653）致胰岛素敏感性作用与脂联素的关系研究

摘要

目的:(1)研究二甲双胍对高胰岛素血症患儿血清脂源性细胞因子的影响；(2)尝试对国内外同类模型稍加改进，建立一种更符合2型糖尿病特点的动物模型；(3)观察实验性2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗、糖尿病发生发展过程中糖脂代谢指标及CRP水平的变化，并检测FFA、IL-6、TNF-α、脂肪因子瘦素、脂联素的变化及罗格列酮治疗对这些变化的影响，以进一步明确糖尿病的发生、发展及罗格列酮的作用机制；(4)观察2型糖尿病大鼠脂肪组织脂联素及骨骼肌组织脂联素受体R1基因表达的变化及罗格列酮治疗对其变化的影响。分析血中影响脂联素及其受体R1基因表达的因素；(5)从细胞信号转导水平来探讨罗格列酮增加脂联素分泌的分子机制。 方法：(1)通过对空腹血糖和空腹胰岛素的筛查发现儿童和青少年肥胖者中的高胰岛素血症患儿。用二甲双胍对高胰岛素血症的肥胖患儿进行及早干预，研究治疗前后糖代谢、脂源性激素等指标的变化，以进一步了解二甲双胍的作用特点，为临床用药提供参考。(2)采用幼龄雄性Wistar大鼠高脂饮食诱导6周，禁食12h后尾静脉注射小剂量链脲佐菌素STZ25mg.Kg-1破坏胰岛β细胞的方法，普通饲料提供总热量为14.88J.g1(蛋白质20％，碳水化合物53％，脂肪9％)；高脂饲料总热量为20.08J.g-1(蛋白质15％，碳水化合物51％，脂肪25％。口服糖耐量试验确诊的方法建立2型糖尿病模型。(3)将糖尿病大鼠分为两组，其中一组用罗格列酮治疗7周。于实验过程的第6、9、16周分别取血检测空腹血糖、空腹胰岛素及血清CRP。另设普通饲料组作对照。试验结束时检测FFA、IL-6、TNF-α、脂肪因子瘦素、脂联素水平。CRP检测用免疫散射比浊法测定。脂联素用ELISA方法检测。(4)口服葡萄糖耐量试验筛选出糖尿病大鼠，随机分为糖尿病组和罗格列酮治疗组，并设正常对照。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测脂肪组织脂联素及骨骼肌组织脂联素受体R1mRNA表达。ELISA法检测血清脂联素，同时检测血清糖、脂代谢指标和其他脂肪因子水平。(5)用25mmol/l葡萄糖加0.6nmol/l胰岛素前孵育SW872脂肪细胞18小时，制成胰岛素抵抗细胞模型。将不同浓度的罗格列酮作用于此模型，孵育24小时，观察其葡萄糖转运及脂联素分泌的变化。用信号通路阻断剂GW9662、Wortmannin、AG490作用后再观察罗格列酮对葡萄糖转运及脂联素分泌的影响。 结果:(1)肥胖患儿血清脂联素水平明显下降，其下降与胰岛素抵抗程度相平行。轻中度肥胖组及重度肥胖组脂联素水平与对照组相比，差异均有显著性。而二甲双胍治疗对肥胖者的低脂联素血症没有明显的改善，轻中度肥胖组治疗后(8.9±2.3μg/ml)与治疗前(8.4±3.2μg/ml)相比，P＞0.05；重度肥胖组治疗后7.03±3.0μg/ml与治疗前6.5±1.2μgμg/ml相比P＞0.05。与对照组相比，肥胖者血清抵抗素水平明显升高，而治疗后抵抗素水平(轻中度肥胖组22.0±5.1ng/ml/16.5±6.0ng/ml，重度肥胖组30.6±11.7ng/ml/22.3±5.2ng/ml)不但没有降低，反而明显升高，差异有统计学意义。肥胖组存在严重的瘦素抵抗，而二甲双胍治疗可有效改善高瘦素血症，与治疗前相比(轻中度肥胖组19.6±6.3ng/ml/24.3±1.8ng/ml，重度肥胖组24.7±5.3ng/ml/30.2±5.1ng/ml)，差异显著。(2)大鼠在第7周STZ注射前即已形成高胰岛素血症，胰岛素抵抗。到第9周即已有高甘油三脂、高胆固醇血症。(3)2型糖尿病形成过程中，炎性因子CRP动态升高，9周(15.00±3.95mg/L)、16周(14.00±3.37mg/L)明显高于6周(7.00±3.51mg/L)，P＜0.05；糖尿病组明显高于正常对照组。糖尿病组血清IL-6(251.50±120.11mg/L比145.13±40.44mg/L)、TNF-α(2.95±0.93ng/ml比2.20±0.55ng/ml)、瘦素(24.89±12.84ng/ml比16.14±5.98ng/ml)水平升高，P＜0.05；而脂联素(5.50±2.05μg/ml比8.68±2.52μg/ml)水平明显下降。罗格列酮治疗可有效降低升高的CRP、IL-6、TNF-α及瘦素，升高减低的脂联素水平。(4)糖尿病组血清脂联素明显降低(正常组8.68±2.52μg/ml，糖尿病组5.50±2.05μg/ml，治疗组8.57±3.05μg/ml，F=3.752,P＜0.05)；脂肪组织脂联素mRNA表达降低(正常组0.81±0.24，糖尿病组0.37±0.12，治疗组0.73±0.25，F=10.239，P＜0.01)，罗格列酮治疗使两者显著改善。糖尿病组骨骼肌组织脂联素受体R1mRNA表达没有明显改变(正常组0.67±0.16，糖尿病组0.74±0.23，治疗组0.72±0.18，F=2.532，P=0.103)。相关分析显示脂肪组织脂联素mRNA表达与血清胰岛素(r=-0.66，P＜0.05)、甘油三酯(r=-0.58，P＜0.05)、胆固醇(r=-0.49，P＜0.05)、白介素-6(r=-0.49，P＜0.05)、肿瘤坏死因子-α(r=-0.43，P＜0.05)呈负相关，而脂联素受体R1mRNA表达则与血清糖、脂代谢指标及脂肪因子间无明显相关性。(5)罗格列酮增加SW872脂肪细胞胰岛素抵抗模型的2-DOG葡萄糖转运，同时增加脂联素的分泌。PPAR-γ核受体阻断剂GW9662、PI-3K信号通路阻断剂Wortmannin可明显阻滞罗格列酮刺激的糖转运和脂联素分泌，而JAK-STAT2作用不明显。 结论:(1)本研究数据提示二甲双胍作为降糖药和胰岛素增敏剂，在对脂源性激素的改善上，有其局限性。(2)STZ注射后OGTT显示糖尿病成功率高。此方法建立的大鼠模型，极好地模拟了人类的糖尿病发生、发展过程，为后续试验打下基础。(3)罗格列酮可全面改善2型糖尿病血清脂肪细胞因子紊乱。(4)糖尿病时骨骼肌组织脂联素受体R1基因表达无改变；血清脂联素水平下降由脂肪组织脂联素mRNA表达降低引起，罗格列酮治疗可以改善这种降低。(5)这些数据说明，罗格列酮直接作用于PPARs以增加脂联素分泌，或通过PI-3K间接作用于PPARs来以影响脂联素的基因转运。

目录

缩略语一览表

前言

第一部分二甲双胍对高胰岛素血症肥胖儿童血清脂源性激素脂联素、瘦素、抵抗素的影响

对象和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分2型糖尿病大鼠动物模型的建立及其胰岛素抵抗特点

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分罗格列酮对2型糖尿病大鼠血清细胞因子及脂肪激素的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分2型糖尿病大鼠脂肪组织脂联素和骨骼肌组织脂联素受体R1基因表达的变化及与血清参数的关系研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第五部分罗格列酮调节脂联素分泌和表达的信号机制

材料与方法

结果

讨论

参考文献

脂联素与2型糖尿病

ghrelin的内分泌学作用

攻读博士期间发表的论文

致谢