Endostatin、VCAM-1在BMT小鼠骨髓造血重建中的作用及川芎嗪对其表达水平的影响

摘要

第一部分川芎嗪对BMT小鼠骨髓组织中Endostatin、VCAM-1表达的影响及意义 目的：探讨川芎嗪对骨髓移植(BMT)小鼠骨髓中Endostatin、VCAM-1表达水平的影响及其促进骨髓造血重建的机制。 方法：72只清洁级近交系BALB/c小鼠(H-2d，MLSb)随机分为正常组、生理盐水组和川芎嗪组。正常组未作任何处理，生理盐水组和川芎嗪组在BMT后分别喂饲相同剂量的生理盐水(0.2ml/只，每天2次)和川芎嗪(2mg/只，每天2次)，直至处死为止。BMT后第7、14、21、28天取眼眶血计数外周血细胞，取股骨计数骨髓单个核细胞(BMMNC)，HE染色分析骨髓造血组织容量、脂肪组织容量和成熟红细胞容量变化，用流式细胞仪检测骨髓BMMNCs的VLA-4表达水平，以免疫组织化学法检测骨髓组织中Endostatin、VCAM-1的表达水平。 结果：川芎嗪组小鼠在BMT后第7、14、21天外周血红细胞以及BMT后第7、14、21、28天外周血白细胞、血小板、BMMNC计数、骨髓造血组织容量以及VCAM-1表达水平均显著高于生理盐水组(P＜0.01或P＜0.05)，成熟红细胞容量和Endostatin表达水平均明显低于生理盐水组(P＜0.01或P＜0.05)。川芎嗪组小鼠脂肪组织容量在BMT后第7、14天明显高于生理盐水组(P＜0.01)，在第21、28天明显低于生理盐水组(P＜0.01)。流式细胞仪检测到正常组VLA-4有表达，BMT后第7、14d川芎嗪组和生理盐水组VLA-4的荧光强度显著低于正常组(P＜0.01或P＜0.05)，且川芎嗪组VLA-4在BMT后第14、21、28d均显著高于生理盐水组(P＜0.01)。免疫组织化学法检测BMT后第7、14、21、28天川芎嗪组和生理盐水组Endostatin表达水平显著低于正常组(P＜0.01或P＜0.05)，且川芎嗪组低于生理盐水组(P＜0.01或P＜0.05)；到第28天生理盐水组已基本恢复正常，而川芎嗪组仍未恢复正常水平。BMT后第7、14、21天川芎嗪组和生理盐水组VCAM-1的表达均明显低于正常组(P＜0.01或P＜0.05)，且川芎嗪组明显高于生理盐水组(P＜0.01或P＜0.05)，到第28天，川芎嗪组VCAM-1的表达已恢复正常，而生理盐水组仍未恢复正常，两组之间有显著性差异(P＜0.01)。 结论：川芎嗪可能通过下调血管新生抑制因子Endostatin的表达而促进造血微环境中微血管和静脉窦的修复和血供的重建，川芎嗪还可以增强黏附分子VCAM-1、VLA-4的表达，促进归巢的干/祖细胞与血管内皮间的黏附作用，加强造血细胞与基质细胞之间的相互作用，促进骨髓造血细胞的恢复，促进骨髓移植后早期造血重建。 第二部分川芎嗪对BMT小鼠骨髓基质细胞表达Endostatin、VCAM-1的影响 目的：探讨同基因骨髓移植(BMT)小鼠骨髓基质细胞Endostatin及黏附分子VCAM-1的表达及川芎嗪对其影响。 方法：取健康BALB/C小鼠(H-2d，MLSb)，随机分为三组：正常组(不做处理)，骨髓移植对照组(简称生理盐水组)和骨髓移植+川芎嗪治疗组(简称川芎嗪组)。BMT模型建立后，生理盐水组和川芎嗪组分别胃饲生理盐水(0.2ml/只，2次/天)和川芎嗪注射液(每次2mg/只，2次/天)，直至处死为止。在BMT后第7、14、21、28d颈椎脱臼处死小鼠，采用间接免疫荧光法、Westernblot方法检测骨髓基质细胞Endostatin、VCAM-1蛋白表达水平，RT-PCR检测骨髓基质细胞Endostatin、VCAM-1mRNA表达水平。 结果：BMT后第7、14、21、28d，川芎嗪组和生理盐水组骨髓单个核细胞培养的基质细胞EndostatinmRNA及其蛋白的表达水平均明显低于正常组(P＜0.05或P＜0.01)，且川芎嗪组低于生理盐水组(P＜0.05)；到BMT后第28d生理盐水组已基本恢复正常，而川芎嗪组仍未恢复正常水平。BMT后川芎嗪组和生理盐水组小鼠骨髓基质细胞VCAM-1mRNA及其蛋白表达显著下降，随着时间延长川芎嗪组在第21、28d已恢复正常水平，但生理盐水组仍明显低于正常(P＜0.01或P＜0.05)，两组之间有显著性差异(P＜0.01)。相关分析显示，生理盐水组骨髓基质细胞Endostatin和VCAM-1mRNA及其蛋白表达呈负相关，而川芎嗪组Endostatin和VCAM-1mRNA及其蛋白表达呈正相关。 结论：川芎嗪能提高BMT小鼠骨髓基质细胞黏附分子的表达，加快BMT后HSPC的归巢及在骨髓中的增殖；且能通过反馈调节BMT小鼠骨髓基质细胞新血管生成抑制因子Endostatin的表达，促进骨髓微环境的修复，加速移植后骨髓的造血重建。 第三部分ENDOSTATIN反义寡核苷酸对骨髓移植小鼠造血重建的影响 目的：Endostatin反义寡核苷酸转染骨髓基质细胞后观察其在BMT小鼠骨髓造血恢复过程中的作用。 方法：以脂质体作为转染载体，转染不同剂量的FITC标记的Endostatin反义寡核苷酸，荧光倒置显微镜观察转染效率，用流式细胞仪检测最佳转染条件时转染率，用共聚焦显微镜、Westernblot和RT-PCR方法检测最佳转染条件下Endostatin反义寡核苷酸对Endostatin、VCAM-1mRNA及其蛋白表达水平的影响。实验分为4组：1正常组：未经任何处理。2对照组：BMT组。3BMT+转染Endostatin反义寡核苷酸组。4BMT+转染Endostatin错义寡核苷酸组。用PI法检测各组细胞凋亡率。 结果：以Endostatin反义寡核苷酸转染骨髓基质细胞后，EndostatinmRNA及其蛋白表达被显著抑制(P＜0.01)，表明转染成功。同时，Endostatin反义寡核苷酸转染有效促进了VCAM-1mRNA及其蛋白表达，而Endostatin错义寡核苷酸对Endostatin和VCAM-1的表达基本无影响(P＜0.01)。转染Endostatin反义寡核苷酸可明显降低骨髓基质细胞凋亡率。 结论：Endostatin反义寡核苷酸可使骨髓基质细胞上Endostatin的表达水平显著降低，可能促进骨髓微血管生成，改善骨髓微环境的血液供应，促进骨髓造血重建。

目录

前 言

第一部分川芎嗪对BMT小鼠骨髓组织中Endostatin、VCAM-1表达的作用研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分川芎嗪对BMT小鼠骨髓基质细胞Endostatin、VCAM-1表达的作用研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分ENDOSTATIN反义寡核苷酸对胃髓移植小鼠造血重建的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述内皮抑制素的研究现状

附录读博期间以第一作者发表的论文

致谢