WWOX基因在人非小细胞肺癌组织及肺腺癌细胞株A549中的异常表达研究

摘要

肺癌的发病率及死亡率近年来呈明显升高趋势，它严重影响着人类的健康和生命，阐明肺癌的发病机制对提高肺癌的早期诊断率及治疗效果具有十分重要的意义。近年来的研究发现WWOX基因杂和性丢失及外显子转录本缺失和人类多种肿瘤，如乳腺癌、多发性骨髓瘤、食管癌等的发生、发展有关，但对原发支气管肺癌的WWOX基因杂合性丢失及外显子转录本缺失情况报道甚少，对WWOX基因杂合性丢失、外显子丢失与肺癌临床指标相关情况及WWOX蛋白在肺癌中的表达水平也尚不完全清楚。本研究应用分子生物学的技术和方法对WWOX基因在非小细胞肺癌发病中的作用进行了探讨，以期对肺癌的早期诊断及治疗提供新的思路和依据。 第一部:分抑癌基因WWOX第六至八外显子在人非小细胞肺癌组织中转录本丢失及点突变的研究 目的:对非小细胞肺癌组织中的抑癌基因WWOX(WWdomaincontainingoxidoreductase)第六至八外显子转录本缺失及点突变进行研究，并探讨它们与临床病理指标的可能关系。 方法:收集非小细胞肺癌手术后的标本44例，提取癌组织及癌旁正常组织中的RNA；采用RT-PCR和DNA测序方法研究WWOX基因6-8外显子的丢失及点突变。 结果:44例癌旁正常肺组织中仅有3例(6.8％)检测出WWOX基因6-8外显子转录本丢失，而在44例非小细胞肺癌组织标本中则检测出28例(63.6％)缺失(p＜0.05)；其余16例无6-8外显子转录本丢失的肺癌标本及相对应的癌旁正常组织标本经DNA直接测序证实WWOX6-8外显子均未发现点突变；WWOX基因6-8外显子转录本丢失率与性别(p=0.035)、吸烟(p=0.001)、肿瘤组织类型(p=0.003)明显相关，但与肿瘤临床分期无关(p=0.279)。 结论:研究表明WWOX基因在人非小细胞肺癌组织中存在较高的6-8外显子转录本缺失率，提示抑癌基因WWOX6-8外显子在肺非小细胞肺癌的发生发展中可能有重要作用；同时WWOX基因6-8外显子转录本的缺失与吸烟严重程度分级密切相关也预示WWOX基因6-8外显子可能是肺癌患者吸烟致癌的重要分子标志；点突变不是WWOX基因6-8外显子失活的主要方式。 第二部分:人非小细胞肺癌组织中WWOX基因杂合性丢失的研究 目的:检测非小细胞肺癌组织中WWOX基因的杂合性丢失(LOH)情况，并探讨其与临床病理指标之间的可能关系。 方法:提取40例非小细胞肺癌术后癌组织及相应的癌旁正常组织的DNA,扩增WWOX基因对应的染色体16q23.2-24.1区域的三个微卫星位点多肽性标记(D16S504、D16S3029、D16S3096)，变性聚丙烯凝胶电泳、银染后行LOH认定，并分析WWOX基因的LOH与非小细胞肺癌患者性别、吸烟史、肿瘤组织类型及临床分期之间的可能关系。 结果:40例非小细胞肺癌组织样本中23例(57.5％)发现LOH,而在40例相应癌旁正常组织中则均未发现LOH(0％)，两者相比较具有明显差异(p＜0.01)。进一步研究发现男性的WWOX基因LOH发生率(67.7％)要明显高于女性(22.2％)，吸烟指数＞400年支组(70％)明显高于吸烟指数＜400年支组(27.3％)，鳞癌(73.1％)要明显高于腺癌(28.6％)(p值均＜0.05)，WWOX基因LOH发生率与临床分期无关(p值＞0.05)。 结论:WWOX基因的杂合性丢失频繁出现于非小细胞肺癌组织提示LOH可能是WWOX基因在非小细胞肺癌组织中的重要失活方式；LOH的发生率与性别、吸烟严重程度分级及肿瘤组织类型明显相关预示长期密切与香烟接触可能与LOH的发生有关。 第三部分:WWOX蛋白在人非小细胞肺癌组织中的表达及与临床病理指标之间相关性分析 目的:研究WWOX蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义。 方法:用免疫组化法结合westernblotting法检测50例非小细胞肺癌组织及相对应的癌旁正常组织中WWOX蛋白的表达水平。 结果:50例癌旁正常肺组织中仅有7例(14％)检测出WWOX蛋白失表达，而在50例肺癌组织标本中则检测出29例(58％)缺失(p＜0.01)。WWOX蛋白表达与性别(p=0.018)、吸烟严重程度分级(p=0.000)、肿瘤组织类型(p=0.003)明显相关，但与年龄(p=0.793)、分化程度(p=0.474)及肿瘤临床分期无关(p=0815)。 结论:WWOX蛋白的失表达可能与非小细胞肺癌的发生有关；WWOX蛋白可能是肺癌患者吸烟致癌的重要分子标志。 第四部分:WWOX基因在人肺腺癌细胞株A549中的异常表达研究 目的:检测WWOX(WWdomaincontainingoxidoreductase)基因在人肺腺癌细胞株A549中的异常表达。 方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对WWOX基因6-8外显子在A549细胞中的转录本丢失进行研究；用聚合酶链反应结合二核苷酸重复序列多态性方法检测WWOX基因在A549细胞中的杂合性丢失(LOH)；用免疫印迹分析(Westernblotting)方法检测WWOX基因在A549中的蛋白表达异常。 结果:A549细胞样本发现WWOX基因6-8外显子转录本的丢失，而作为对照的原代培养人气道上皮细胞样本未发现WWOX基因的6-8外显子转录本的丢失(p＜0.01)；A549细胞样本发现D16S3029及D16S3096两个微卫星位点的LOH而对原代培养人气道上皮细胞未发现WWOX基因的杂合性丢失(p＜0.01)；Westernblotting结果显示WWOX基因在A549细胞的蛋白表达(A值为817464.9±64916.64)明显低于在原代培养人气道上皮细胞中的蛋白表达(A值为2150142±64916.6408)(p＜0.01)。 结论:WWOX基因可能在肺腺癌细胞的发生发展中起重要作用；转录本丢失、LOH及蛋白低表达均是WWOX基因在肺腺癌细胞中的失活方式。

目录

缩略语一览表

第一部分抑癌基因WWOX第六至八外显子在非小细胞肺癌组织中丢失及点突变的研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分人非小细胞肺癌组织中WWOX基因杂合性丢失的研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第三部分WWOX蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第四部分新抑癌基因WWOX在肺腺癌细胞株A549中的异常研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

综述 WWOX基因与肿瘤的研究进展

附录 论文发表情况

致谢