芋螺多肽conantokin及其类似物的戒毒功能研究以及SO-3的结构与镇痛关系研究

摘要

芋螺毒素(conotoxin)是来源于海洋芋螺(Conus)毒液的一类活性多肽，大多数芋螺毒素富含二硫键，由10～46个氨基酸组成，具有特定的分子构型，并选择性地作用于细胞膜上特异的电压门控离子通道、配体门控离子通道或G蛋白偶联受体等。与其他肽类毒素相比，芋螺毒素具有分子量小、结构稳定、特异性高等突出优点，不仅可以作为探针用于各种离子通道和受体的类型或亚型的分类和鉴定，也可直接开发为药物或作为新药的先导化合物。本课题旨在探索芋螺多肽conantokins及其类似物的戒毒功能，研究新型镇痛多肽N-型钙通道抑制剂SO-3的功能氨基酸与镇痛活性的关系。 1.芋螺多肽conantokin及其类似物的合成及戒毒活性研究 (1)合成了Fmoc-保护的非天然氨基酸Gla(γ-羧基谷氨酸)，为多肽的合成提供了原料；(2)用Fmoc法固相合成得到8个对NMDA受体亲和力及亚基选择性不同的conantokins及其类似物，并用凝胶色谱、离子交换色谱、反向HPLC对粗肽进行了纯化，得到纯度高于85％的多肽；(3)在纳洛酮催促戒断吗啡依赖小鼠模型上，首次观察到conantokins及其突变体具有较强的戒毒作用。 结果显示，所选用的conantokins及其类似物均能显著减少吗啡依赖小鼠的戒断跳跃，抑制作用呈剂量依赖性(2.5-15nmol/kg)。其抑制戒断跳跃的能力明显高于其他NMDA受体非竞争性拮抗剂如美金胺(ip，46.3μmol/kg)、胍丁胺(icv,11μmol/kg)及NMDA受体NR2B亚基选择性抑制剂艾芬地尔(1.25μmol/kg，icv；25μmol/kg，ip)，表明Conantokins及其类似物在抑制吗啡依赖方面很有应用潜力。 同时发现，在icv15nmol/kg剂量下，NR2B亚基选择性抑制剂con-G使吗啡依赖小鼠平均跳跃次数减少89.0％，同为NR2B亚基选择性抑制剂的con-G[S16Y]、con-G[γ7K]可完全抑制吗啡依赖小鼠的戒断跳跃，然而具有更高NMDA受体抑制活性但对亚基无选择性的con-R(1-17)、Ala-con-G在该剂量下使吗啡依赖小鼠的平均跳跃次数仅减少40.2％和37.8％。表明conantokins的戒毒活性与其对NMDA受体的抑制能力并无线性关系，而与其对NMDA受体NR2B亚基的特异选择性有关，对NR2B亚基的选择性越高，其抑制吗啡依赖小鼠戒断症状的作用越强。 2.ω-芋螺毒素SO-3的结构与镇痛活性关系研究 (1)通过对照其他具有高镇痛活性的ω-芋螺毒素MVIIA、CVID的功能位点及分子计算，设计了5个SO-3类似物b(SO-3[R10K，I11L])、c(SO-3[I11L，A12M])、d(SO-3[A3S，A4K，A12M])、e(SO-3[A3S，R10K，I11K，A12M])和f(SO-3[A4P，P7A]))；(2)合成了上述SO-3类似物直链肽，探索了不同氧化条件对三对二硫键正确折叠的影响，并用反向HPLC纯化；(3)利用热板实验、醋酸扭体实验、福尔马林实验测定了5个SO-3类似物的镇痛活性，并用放射配体结合试验测定了它们与大鼠突触膜的结合能力。 结果表明，除e外，类似物在体外动物模型中都具有较高的镇痛活性，而且镇痛作用呈剂量依赖性，镇痛作用强弱顺序为SO-3＞f＞d＞c＞b＞＞e。在放射配体结合试验中，5个类似物对N型钙通道的亲和力顺序为f＞SO-3＞d＞c＞b＞＞e。该结果与镇痛活性结果基本一致，表明ω-芋螺毒素SO-3及其类似物的镇痛活性与其对钙通道的亲和力具有相关性。 上述结果表明在ω-芋螺毒素SO-3中Ile11为重要的功能氨基酸，Ala12被Met取代后对活性影响不大，Pro7位于对构象限制十分重要，Pro7被Ala取代及Ala4被Pro取代后，SO-3毒性明显增大。 创新之处： (1)首次验证了conantokins及其类似物具有抑制吗啡依赖(戒毒)活性。 (2)得到conantokins抑制吗啡依赖的活性与其对NMDA受体NR2B亚基的选择性相关的结论。 (3)发现ω-芋螺毒素SO-3及其类似物的镇痛活性与其对N型钙通道的亲和力具有相关性。 (4)得出了ω-芋螺毒素SO-3的镇痛活性与其结构的关系，为ω-芋螺毒素SO-3的进一步改造提供了基础数据。

目录

缩略词表

第一部分芋螺多肽conantokin及其类似物的合成及戒毒活性研究：1前言

第一部分芋螺多肽conantokin及其类似物的合成及戒毒活性研究：2芋螺多肽conantokins及其类似物的选择和合成

第一部分芋螺多肽conantokin及其类似物的合成及戒毒活性研究：3芋螺多肽conantokin及其类似物对小鼠吗啡戒断症状的抑制作用

第一部分芋螺多肽conantokin及其类似物的合成及戒毒活性研究：4小结

第二部分ω-芋螺毒素SO-3的结构活性关系研究：1前言

第二部分ω-芋螺毒素SO-3的结构活性关系研究：2 SO-3类似物的设计、合成、结构鉴定

第二部分ω-芋螺毒素SO-3的结构活性关系研究：3 SO-3及其类似物的活性研究

第二部分ω-芋螺毒素SO-3的结构活性关系研究：4小结

结语

参考文献

综述：α-芋螺毒素构效关系的研究进展

附图

致谢