Nrf2/ARE通路在溴氰菊酯神经毒性中的作用和机制

摘要

拟除虫菊酯类化合物是根据天然除虫菊素的结构逐步衍化而发展起来的一类新型人工合成农药，拟除虫菊酯作为一种神经毒物，其神经毒性作用机制尚未完全明了。最近研究表明，新发现的Nrf2/ARE-驱动靶基因通路具有神经保护作用。本研究以“Nrf2——ARE驱动的靶基因表达——抗氧化性物质(酶)”为轴线，以溴氰菊酯(DM)引起神经组织或细胞氧化应激为出发点，利用整体动物和体外细胞实验模型，应用生物化学与分子细胞生物学技术和方法来研究溴氰菊酯对Nrf2表达和核转位以及Nrf2驱动靶基因表达的影响和可能的机制与意义。主要研究结果如下： 第一部分溴氰菊酯对神经组织和细胞的氧化应激作用和机制 第1节溴氰菊酯对神经组织和细胞的脂质过氧化作用及对抗氧化系统的影响 目的观察溴氰菊酯(DM)诱导大鼠大脑组织和PC12细胞的脂质过氧化作用以及对抗氧化系统的影响，为证实氧化应激参与DM中毒的机制提供依据。 结论氧化应激是DM神经毒性的机制之一；表现为DM升高MDA含量，对SOD活性、GSH含量以及γ-GCS和GR活性产生影响；γ-GCS和GR活性下降可能是DM导致海马组织GSH含量降低的主要机制；而影响GR及CuZn-SOD酶活性的机制可能是转录后机制。 第2节溴氰菊酯对神经组织和细胞活性氧生成的影响和机制初探 目的研究溴氰菊酯对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞和大鼠脑组织活性氧(ROS)生成的影响，以及氧化还原调节剂和抗氧化剂在溴氰菊酯对PC12细胞活性氧(ROS)生成影响中的作用。 结论DM能诱导机体组织和细胞ROS生成增高，可能是DM产生氧化应激的原因之一；NAC、BSO和tBHQ处理能削弱DM诱导细胞增高的ROS，巯基水平在DM增高ROS生成中有重要作用。 第二部分溴氰菊酯对神经组织和神经细胞Nrf2/ARE通路的影响和机制 目的研究溴氰菊酯(DM)对大鼠脑组织、原代胶质细胞或PC12细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)、血红素氧合酶(HO-1)及转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)基因mRNA和蛋白表达的影响，以及初步研究DM对Nrf2/ARE通路的影响机制。 结论DM多次染毒抑制大鼠海马和脑皮层中GCS1基因mRNA表达，激活转录因子Nrf2活性和诱导GCS-HS蛋白的表达；DM单次染毒后，大鼠海马GCSh和GCS1mRNA基因表达出现上调，而脑皮层GCSh基因mRNA表达出现下调，Nrf2基因mRNA表达出现上调。体外DM能诱导细胞Nrf2表达并激活Nrf2活性，驱动Nrf2的下游基因(HO-1、GCS)mRNA和蛋白的表达，总之，体外DM可诱导Nrf2/ARE通路。DM激活Nrf2的机制除了部分增高转录水平诱导Nrf2之外，DM激活Nrf2的作用机制是活性氧依赖性和非GSH耗竭依赖性的。DM对HO-1或GCS-HS基因表达的影响机制较复杂，DM对不同的基因表达影响的机制不同；Nrf2可能在DM对这些基因表达的调控中起作用，其它多种氧化还原敏感的转录因子也可能参与。大剂量DM处理PC12细胞12h轻微地抑制GCS酶活性。提示Nrf2可能是防治DM中毒的新靶点，将为农药中毒防治研究提供新思路。 第三部分Nrf2/ARE通路在溴氰菊酯神经毒性中的意义初探 目的观察Nrf2/ARE通路诱导剂tBHQ预处理对DM增高PC12细胞[Ca2+]i(作为DM的细胞毒性指标)的影响，探讨Nrf2/ARE通路在DM诱导的神经毒性中的作用和意义。 结论Nrf2/ARE通路的诱导剂tBHQ预处理能降低DM增高的[Ca2+]i，减弱DM对PC12细胞的毒性，提示tBHQ通过改变DM诱导的[Ca2+]i紊乱部分地提供保护，Nrf2/ARE通路在DM神经毒性中发挥保护作用。 总之，本课题“Nrf2/ARE通路在DM神经毒性中的作用和机制”的研究初步得出的结论是：DM暴露可诱导机体ROS生成、降低抗氧化系统，造成促氧化系统和抗氧化系统平衡失调而激活Nrf2、诱导其靶基因H0-1和GCS的表达；Nrf2/ARE通路诱导剂tBHQ能削弱DM的毒性作用(钙离子增高)，这些首次的发现意味着神经系统或神经细胞中Nrf2/ARE通路参与农药中毒的机制，可诱导该通路发挥其对机体和细胞的神经保护作用。初步形成的学说见图1。

目录

独创性声明及学位论文版权使用授权书

缩写词

前言

第一部分溴氰菊酯对神经组织和细胞的氧化应激作用和机制

第二部分溴氰菊酯对神经组织和神经细胞Nrf2/ARE通路的影响和机制

第三部分Nrf2/ARE通路在溴氰菊酯神经毒性中的意义初探

总结

致谢

综述Keap1-Nrf2/ARE通路在分子毒理学中的研究进展

附录