洋葱假单胞菌脂肪酶的固定化及其催化合成生物柴油的工艺研究

摘要

脂肪酶的固定化技术有助于提高酶的稳定性和维持酶的催化活力，使酶能够在工程化条件下重复使用，从而降低了生物工业行业的生产成本。本文研究了以四甲氧基硅烷(TMOS)和甲基三甲氧基硅烷(MTMS)为前驱体的溶胶-凝胶法(sol-gel)固定洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶，优化了固定化条件。结果表明，当TMOS为2mmol和MTMS为10mmol时，最优固定化条件是：水与硅烷前驱体摩尔比为10，PEG400为120μL，给酶量为200mg。在此条件下固定化酶的蛋白质回收率为93.7%，pNPP水解比活力为游离酶的1.54倍。
　　 本研究考察了固定化酶与游离酶的酶学性质差异。结果表明，80℃以下固定化酶能保持80% 以上的酶活，而游离酶在50℃以上活力急剧降低，到80℃时残余酶活约为10%；固定化酶在50%的甲醇中处理48 h能保持85％的酶活，在90%的乙醇中处理48 h能保持31%的酶活，而游离酶残余酶活只有69％和0；固定化酶的pH稳定性与游离酶相比也有一定程度的提高。测定的酶反应动力学参数为：固定化酶的Vmax为12.3mmol/min·mg，Km值为4.04mmol/L，游离酶的Vmax为8.0mmol/min·mg，Km值为13.64mmol/L，该结果表明固定化酶比游离酶有更好的底物亲和性和催化活力。比较了来源于日本天野酶公司的七种游离脂肪酶酯交换效率的差异，筛选出酯交换效率最高的Lipase PS，采用溶胶-凝胶法固定化后用于催化大豆油制备生物柴油；系统研究了固定化Lipase PS催化大豆油与甲醇酯交换反应合成生物柴油工艺中的各种影响因子(包括酶用量、醇油比、含水量、反应温度、反应时间、溶剂等)对酯交换效率的影响。结果表明，通过酯交换反应，催化4.5g大豆油合成生物柴油的最佳反应工艺参数为：固定化酶646mg，醇油比4:1，含水量6%，反应温度40℃。此条件下反应72h后，甲酯的最高得率为96.33%，高出游离酶16.3个百分点，且固定化酶重复使用10次后仍能保持60％的酶活。