大鼠前庭内侧核胆碱能受体和γ-氨基丁酸受体介导的钙离子荧光显像及信息转导机制研究

摘要

第一部分乙酰胆碱对大鼠前庭内侧核钙离子荧光强度的影响
　　 目的：探讨大鼠前庭内侧核胆碱能受体介导的细胞内游离钙离子水平的变化。方法：应用激光共聚焦显微镜离子显像技术对前庭内侧核离体脑片中被荧光颜料Fluo-3AM 标记的细胞内游离钙离子浓度的变化进行实时监测。结果：大鼠前庭内侧核细胞对乙酰胆碱敏感，10-5～10-2 M 乙酰胆碱可以浓度依赖性的引起细胞内游离钙离子浓度的增高，其中1mM是最大药效浓度。胆碱能M 受体拮抗剂阿托品(1μM)可以使1mM 乙酰胆碱引起的前庭内侧核神经元钙离子荧光的增强幅度降低55[％]，神经元胆碱能N 受体的拮抗剂美加明(10μM)可以使1mM 乙酰胆碱引起的前庭内侧核神经元钙离子荧光的增强幅度降低49[％](n=5)。两种拮抗剂之间对前庭内侧核钙离子荧光的影响没有显著性差异(P>0.05)。结论：前庭内侧核胆碱能受体可以介导细胞内游离钙离子浓度的升高，呈浓度依赖性，并且，毒蕈碱受体和烟碱受体均参与了此效应。
　　 第二部分大鼠前庭内侧核毒蕈碱受体介导的钙离子荧光显像研究
　　 目的：探讨大鼠前庭内侧核中毒蕈碱受体对细胞内游离钙离子浓度的调控，及其调控机制。方法：应用激光共聚焦显微镜离子显像技术技术对前庭内侧核离体脑片中被荧光颜料Fluo-3AM 标记的细胞内游离钙离子浓度的变化进行实时监测。结果：5～100 μM的传统的毒蕈碱受体的激动剂Muscarine chloride 可以浓度依赖性的引起细胞内游离钙离子浓度的增高，50 μM是最大药效浓度。该效应可以被thapsigargin 明显抑制(P<0.01)，而在无钙脑脊液或存在EGTA的情况下，该效应无明显变化(P>0.05)。 并且，Muscarine chloride 引起的细胞内游离钙离子浓度增高的效应可以被毒蕈碱m1和m3 受体的特异性拮抗剂pirenzepine和 4-DAMP 明显抑制(P<0.05)，而毒蕈碱m2和m4 受体的特异性拮抗剂methoctramine和tropicamide 无明显抑制作用(P>0.05)。结论：毒蕈碱受体通过前庭内侧核细胞内钙库对钙离子的释放介导细胞内游离钙离子浓度的升高。并且，此效应是通过毒蕈碱m1和m3 亚型受体来实现的。
　　 第三部分大鼠前庭内侧核烟碱受体介导的钙离子荧光显像研究
　　 目的：探讨大鼠前庭内侧核中烟碱受体对细胞内游离钙离子浓度的调控，及其调控机制。方法：应用激光共聚焦显微镜离子显像技术对大鼠前庭内侧核离体脑片中被荧光颜料Fluo-3AM 标记的细胞内游离钙离子浓度的变化进行实时监测。结果：10～
　　 500 μM的传统的烟碱受体的激动剂nicotine 可以浓度依赖性的引起细胞内游离钙离子浓度的增高，100 μM是最大药效浓度。该效应可以被EGTA和nifedipine 明显抑制(P<0.01)，在无钙人工脑脊液中，该效应亦可被明显抑制(P<0.01)。但是，mibefradil 及thapsigargin 对nicotine 引起的细胞内游离钙离子浓度增高的效应均无明显抑制作用(P>0.05)。此外，烟碱α 4 β2 亚型受体的特异性拮抗剂Dihydro-β-erythroidine 对nicotine引起的效应有明显的抑制作用(P<0.01)，而烟碱α 7 亚型受体的拮抗剂methyllycaconitine 则无明显效果(P>0.05)。结论：烟碱受体可以介导前庭内侧核细胞内钙离子水平呈浓度依赖性的升高，是通过细胞外钙离子内流来实现的，至少有L型电压门控钙离子通道的开放参与了此过程，并且，该效应是通过烟碱α 4 β2 亚型受体实现的，而非烟碱α 7 亚型受体。
　　 第四部分大鼠前庭内侧核γ-氨基丁酸受体介导的钙离子荧光显像研究
　　 目的：探讨大鼠前庭内侧核中γ-氨基丁酸受体介导的细胞内游离钙离子浓度变化，以及对胆碱能受体效应的影响，并探讨其调控机制。方法：应用激光共聚焦显微镜离子显像技术对大鼠前庭内侧核离体脑片中被荧光颜料Fluo-3AM 标记的细胞内游离钙离子浓度的变化进行实时监测。结果：5μM、20μM、100μM、500μM GABA对前庭内侧核钙离子荧光强度没有显著性影响 (P>0.05)，对毒蕈碱受体激动剂muscarine chloride 引起的前庭内侧核钙离子荧光强度变化也没有显著影响(P>0.05)，而对100μM nicotine 引起的前庭内侧核钙离子荧光强度的增强有明显的抑制作用(P<0.05)，呈浓度依赖性，其中，100μM GABA 可以达到最大抑制效应。GABAB 受体选择性激动剂baclofen 对50μM muscarine chloride和100μM nicotine 引起的钙离子荧光增强均无明显抑制作用(P>0.05)。结论：GABA为抑制性神经递质，对前庭内侧核细胞内钙离子浓度没有直接的影响，但是可以对烟碱受体引起的细胞外钙离子的内流有抑制作用，并且该效应是通过GABA 能A型受体来实现，机制可能是阻断电压门控钙离子通道的开放。