紫杉醇生物合成酶DBAT启动子的克隆与植物表达载体的构建

摘要

雄踞抗癌药物市场首位，被广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌的紫杉醇药物来源非常紧张。细胞大规模培养是解决紫杉醇药源问题最具前景的方案，但目前尚未用于紫杉醇的生产，存在的主要问题是，红豆杉高产细胞系在利用过程中出现紫杉醇产量下降的现象，导致紫杉醇不能稳定高产，使得细胞大规模培养生产紫杉醇的成本仍高于天然提取，限制了其产业化进程。特定次生代谢产物合成与否、合成量的多少主要是通过其合成代谢途径中的一系列关键酶的表达及其活性所决定的，转录调控是真核基因表达调控的最主要方式，通过改造关键酶基因的启动子或转入相应的转录因子可激活植物次生代谢产物合成酶的基因表达，可有效地提高目标次生代谢产物的含量。本文拟克隆曼地亚红豆杉细胞紫杉醇合成途径中关键酶基因DBAT启动子，并对其功能进行研究，为下一步克隆相应紫杉醇转录因子打下基础。获得主要结果如下：
　　 ⑴建立了一种曼地亚红豆杉愈伤组织高效诱导的方法。在培养基为MS+0.2 mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+0.5 mg/L NAA(萘乙酸)+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂，pH为5.8-6.0之间条件下，8月份采集的1年生枝条的茎段作为外植体愈伤诱导效果较好于5月份和10月份的，8月份采集1年生枝条的茎段作为外植体愈伤诱导效果优于两年生的，8月份采集的1年生枝条的茎段处理时带少许叶柄的茎段作为外植体时愈伤组织诱导率最高；
　　 ⑵建立了有效提取曼地亚红豆杉细胞基因组DNA的方法。通过三种植物基因组DNA提取方法，对曼地亚红豆杉细胞基因组DNA进行提取试验，寻找出了一种有效的从曼地亚红豆杉细胞中提取高质量、高分子量DNA的方法：SDS-CTAB结合提取DNA的方法较之SDS法和CTAB法能够得到浓度和纯度都较好的曼地亚红豆杉细胞基因组的DNA，这为今后进一步开展的分子生物学研究奠定基础；
　　 ⑶建立了适合曼地亚红豆杉细胞基因组DNA的PCR扩增的反应体系：15 μl体系—DNA模板20 ng/μl；dNTP(10 mM)0.3 μl；MgCl2(25 mM)0.8 μl；Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl)0.3 μl；10×buffer1.5 μl；引物(10 μmol/L)0.2 μl；ddH2O 11.6 μl。程序为：95℃ 4 min(1个循环)；93℃ 1 min，39℃ 1 min40 s，72℃ 2 min20 s(35个循环)；72℃ 10 min(1个循环)；4℃ 10 min(1个循环)；
　　 ⑷建立了一种基于RAPD方法克隆启动子的新方法，并通过此方法成功克隆了紫杉醇生物合成途径中关键酶基因DBAT的启动子序列，该序列长为1054 bp。通过软件分析，该序列含有启动子特有的结构。将此启动子与含有报告基因GUS的植物表达载体pCAMBIA1381融合，成功构建了进行启动子功能验证的表达载体，为下一步转入烟草细胞中进行功能验证奠定基础。