RNA干扰抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞多巴胺释放及细胞凋亡的影响

摘要

第一部分 Nogo-A短发夹样RNA真核表达载体的构建
　　 目的：构建靶向Nogo-A基因的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体。
　　 方法：根据Gene bank中提供的Nogo-A基因核苷酸序列，设计并化学合成2条shRNA，退火后克隆到pGenesil-1质粒的U6启动子下游从而构建重组载体，行限制性内切酶酶切和基因测序进行鉴定。
　　 结果：序列分析结果表明，两个重组质粒的shRNA编码序列均成功插入到预定位置。
　　 结论：成功构建靶向Nogo-A的shRNA真核表达载体，为进一步研究Nogo-A蛋白的功能及轴突再生抑制的基因治疗提供了新的方法。
　　 第二部分短发夹样RNA抑制PC12细胞Nogo-A基因表达的研究
　　 目的：研究Nogo-A shRNA对PC12细胞Nogo-A基因表达的抑制作用，为下一步探索Nogo-A的功能奠定基础。
　　 方法：经脂质体2000将前期构建的两个pGenesil-1/Nogo-A shRNA质粒转染PC12细胞，通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP的表达，分别于转染后48h后应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测Nogo-A Mrna及蛋白表达水平。
　　 结果：与对照组相比，空载体组的Nogo-A Mrna及蛋白表达水平无显着性差异(p>0.05)，而转染pGenesil-1-/Nogo-A组的Nogo-A Mrna及蛋白表达水平均明显下降(p<0.05)。
　　 结论：构建的pGenesil-1-/Nogo-A shRNA重组质粒能有效抑制Nogo-A基因在PC12细胞的表达。
　　 第三部分 RNA干扰抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞多巴胺释放的影响
　　 目的：研究抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞多巴胺释放的影响，探讨Nogo-A在神经内分泌细胞表达的意义。
　　 方法：经脂质体将Nogo-A shRNA真核表达质粒转染到PC12细胞，分别于转染后24h、48h采用高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography，HPLC)检测不同处理组细胞的多巴胺释放量。
　　 结果：与对照组相比，转染48h后Nogo-A shRNA组细胞多巴胺释放量明显减少(P<0.05)，而转染空载体组多巴胺释放量无明显变化(P>0.05)。
　　 结论：Nogo-A基因沉默可以抑制PC12细胞多巴胺的释放，Nogo-A可能参与多巴胺的释放调节。
　　 第四部分 RNA干扰抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞凋亡的影响
　　 目的：研究Nogo-A基因沉默对PC12细胞凋亡的影响。
　　 方法：应用脂质体将Nogo-A shRNA真核表达载体转染到PC12细胞，在转染后不同时间应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性，原位末端标记(TUNEL)法及流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　 结果：与对照组相比，Nogo-A siRNA处理组细胞的增殖活性明显增加(P<0.05)，凋亡率明显下降(P<0.05)。
　　 结论：Nogo-A基因可能与肿瘤细胞凋亡有关。