大鼠肝癌发生过程中PI3K/AKT信号通路在卵圆细胞内作用机制的研究

摘要

本文主要从以下三个部分展开论述：
　　第一部分:
　　目的：建立大鼠卵圆细胞增殖模型,并优化对卵圆细胞分离、鉴定的实验方法。
　　方法：采用15mg/kg灌胃剂量的2-AAF/PH模型诱导大鼠卵圆细胞增殖,术后采用改良的胶原酶灌注消化、密度梯度离心法分离卵圆细胞,用免疫组化,RT-PCR,电镜,细胞免疫荧光的方法鉴定卵圆细胞。并用OV-6免疫组化结果观察卵圆细胞的增殖情况。
　　结果：15mg/kg剂量的2-AAF/PH模型可以稳定地诱导大鼠卵圆细胞增殖。细胞免疫组化,RT-PCR,细胞免疫荧光结果显示有OV-6,AFP,CK-19,ALB,C-Kit的相对特异性的表达。电镜下观察卵圆细胞符合幼稚细胞的特点。卵圆细胞的增殖峰在术后8-11天出现。
　　结论：15mg/kg剂量的2-AAF/PH模型可以稳定地诱导大鼠卵圆细胞增殖,在术后8-11天时分离可最大限度地获取卵圆细胞。
　　第二部分:
　　目的：探讨PI3K/AKT信号通路主要基因在2-AAF/PH模型卵圆细胞增殖中的表达和意义。
　　方法：利用第一部分所建立的2-AAF/PH模型,使用实时定量PCR和Western Blotting对术后不同时期所分离的卵圆细胞内PTEN、AKT、NF-κB的mRNA和蛋白水平进行检测,使用Hoechst33342检测卵圆细胞凋亡情况。使用免疫组化的方法检测肝脏组织内 TGF-α的表达,并分析其相关性和意义。单独或联合使用 PI3K特异性抑制剂 LY294002及特异性抑制剂PDTC体外作用于卵圆细胞系LE6,使用实时定量PCR和Western Blotting对其PTEN、pAKT、NF-κB的mRNA和蛋白水平进行检测。
　　结果：pAKT、NF-κB的mRNA和蛋白水平从术后第8天起显著下降,PTEN则逐渐升高(P<0.05)。卵圆细胞凋亡在PH后第8天起逐渐增高(P<0.05)。TGF-α在术后第6天达到高峰。单独使用LY294002和联合 PDTC使用时可使 LE6细胞内 pAkt, NF-κB mRNA、蛋白表达较未作用前明显下降;而单独使用PDTC作用于LE6细胞后,仅观察到NF-κB表达下降,pAkt mRNA、蛋白水平无明显改变。
　　结论：PI3K/AKT信号通路中PTEN可通过抑制pAKT而下调NF-κB的转录和表达。TGF-α在肝脏微环境中可能刺激PI3K/AKT信号通路调控卵圆细胞的增殖。深入研究PI3K/AKT信号通路可能为卵圆细胞的增殖、分化和肝癌发生的研究提供理论基础。
　　第三部分：
　　目的：研究 PI3K/AKT信号通路主要基因在大鼠肝癌发生过程中卵圆细胞内表达与肝癌发生的关系。
　　方法：采用3’-甲基-4-二甲基氨基偶氮苯(3’-Me-DAB)诱癌,使用实时定量 PCR和Western Blotting的方法对诱癌不同阶段的大鼠卵圆细胞中的 PTEN、pAKT、NF-κB和AFP mRNA和蛋白水平进行检测。
　　结果：PTEN mRNA和蛋白水平在肝癌发生过程中,在卵圆细胞内逐渐降低(P<0.05)与pAKT、NF-κB呈负相关,AFP mRNA和蛋白的表达在癌症的发生过程中无明显变化(P>0.05)。
　　结论：PI3K/AKT信号通路可能参与了卵圆细胞的癌变。PI3K/AKT信号通路可能成为早期监测和预防肝癌发生的靶点。

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中文摘要

英文摘要

第一部分 大鼠卵圆细胞增殖模型的建立及卵圆细胞的分离、鉴定

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 PI3K/AKT通路在大鼠卵圆细胞增殖中的变化趋势的研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 PI3K/AKT信号通路主要基因在大鼠肝癌发生过程中卵圆细胞内表达的相关性的研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

综述一

综述二

附录 攻读学位期间发表的文章

致谢