BK通道门控、转运和结合位点的研究

摘要

离子通道作为一种膜蛋白在动物、植物、单细胞或多细胞生物的细胞膜上广泛存在，产生细胞生物电现象。钙依赖、电压激活的大电导钾通道（BK通道）作为钾离子通道家族中的一员，在线虫、昆虫和哺乳动物的肌肉、脑、胰腺、背根神经节上都有表达。BK通道的a亚基不同剪接变体和四种β亚基一起促成了其电流和功能的多样性。 β2亚基通过其N端的三个疏水性氨基酸FIW产生了失活的BK电流。本文以BK通道b2亚基为研究对象，以HEK293细胞为工具，利用免疫荧光技术，共聚焦显微镜技术，结合分子生物学和电生理学方法，研究了β2亚基的转运机制，探索了其与a亚基的结合位点。主要内容如下： （1）通过在β2的N端增加三个疏水性的氨基酸FIW（dFIW），发现没有记录到预期的失活加强的BK电流，而是记录不到任何电流。通过荧光实验发现这种突变体dFIW造成了其本身和共表达的a亚基的ER滞留。通过突变其N端的带电荷的氨基酸D16E17和E44D45，发现突变体E44D45能使大部分的a亚基上膜，同时能记录到没有失活的BK电流。本文推断E44D45是结合位点之一。 （2）通过在β2亚基的胞外部分加入抗原决定簇c-myc，利用荧光素耦联的抗体检测发现β2亚基不同于b1亚基，它单独不能被运输到HEK细胞膜上，而是被滞留在内质网（ER）。但与a亚基共表达可以被a亚基带上膜。通过切掉其N端或C端的一些序列我们发现β2亚基N端的一段a螺旋（18-31）造成了其ER滞留。通过在其loop的不同位置加抗原，发现K137附近是最容易被抗体接近的区域。 小鼠mslo1形成的BK单通道电流有较长的开放，但线虫dslo（A2/C2/E2/G5/10）在开放时却非常flickery。本文还以BK通道a亚基为研究对象，以非洲爪蟾卵母细胞为工具，利用电生理技术研究BK通道的门控机制。主要内容如下： 本研究发现mSlo的突变体I323T会产生跟dslo（A2/C2/E2/G5/10）类似快速开放的单通道电导，并且还有外向整流的性质。而突变dslo（A2/C2/E2/G5/10）相应位置的亲水性氨基酸T337I，发现该通道开放的单通道电导不再flickery。通过单通道电导分析发现突变体I323T存在不同亚态的亚电导，这是因为四个亚基之间的协同性被破坏造成的。通过对mSlo的I323位点做一系列的突变，发现越疏水性的氨基酸会产生越长的单通道电导。分子动力学模拟表明位于BK通道孔道的四个疏水性氨基酸I323在通道门控过程中起着“开关”作用。因此，本研究证明BK通道的亚电导是由于323位置的四个氨基酸残基的协同性降低和开放几率的降低造成的。