极低密度脂蛋白受体亚型在肿瘤细胞中的变化及其意义探讨

摘要

极低密度脂蛋白受体（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）属于低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）超家族。VLDLR由于第16外显子的选择性剪接从而产生胞外段O-linked糖链结合域缺失的亚型，根据有无此结构域可将VLDLR分为Ⅰ型和Ⅱ型两种亚型。早期研究认为，该受体主要结合富含apoE（载脂蛋白E）的脂蛋白而参与甘油三酯的代谢；与泡沫细胞的形成及动脉粥样硬化的发生发展相关。但由于该基因敲除的小鼠仅表现体脂下降，发育迟缓，因此对该受体研究一直未引起足够重视。近年来的研究发现，因此VLDLR和LDLR家族的其他成员一样被认为是一种“瑞士军刀”样多功能受体。但是对两型受体的功能差异，特别是Ⅱ型受体的独特功能及其生物学意义尚未阐明。 我们的前期工作和已有研究资料表明：⑴、两型受体的分布具有明显的组织细胞特异性：Ⅰ型受体主要分布于脂代谢旺盛的组织，而Ⅱ型受体则主要分布于肾脏、脾脏、肾上腺、睾丸、子宫、卵巢等非肌组织。⑵、在分化程度不同的细胞、组织中两型受体的表达不同：在高分化的胃腺癌细胞系中，Ⅱ型受体低表达或不表达，而在低分化的胃腺癌细胞系中Ⅱ型受体高表达；同样，在多种胃腺癌组织细胞中观察到Ⅱ型受体的表达增多；宫颈癌病变组织中也检测到VLDLRⅡ型的高表达；另外在鸡和小鼠胚胎发育过程中VLDLR两种亚型的表达可发生变化：在胚胎发育早期以Ⅱ型VLDLR的表达为主，而在发育成熟的体细胞中则以Ⅰ型VLDLR表达为主；在胚胎脑中以Ⅱ型VLDLR表达为主，而在成熟分化的脑组织中则以Ⅰ型VLDLR表达为主。⑶、在退行性病变的纤维化脾组织中，Ⅱ型VLDLR则几乎消失；而在阿尔茨海默病病人的老年斑斑块中以Ⅰ型VLDLR表达为主；⑷、最新研究报道认为VLDLR，尤其是Ⅰ型VLDLR，表达减少或不表达会导致肿瘤的形成；且Ⅰ型VLDLR在抑制肿瘤细胞生长方面作用更重要。这些现象强烈提示：VLDLR亚型与细胞的增殖、分化、迁移等细胞活动存在密切关系。但这种关系的生物学意义目前尚不清楚。 uPA-PAI-1复合物和TFPI是VLDLR已知的两种配体，VLDLR与uPA-PAI-1复合物的结合可促进细胞增殖、迁移；而与TFPI结合可抑制细胞的增殖；这些表明VLDLR与不同配体结合可影响截然相反的细胞功能，但这些配体是否通过VLDLR亚型的变化来影响细胞生物学行为尚不清楚。 本研究首先针对VLDLR亚型变化与细胞增殖、迁移之间的关系进行深入研究，探讨VLDLR 亚型的变化与细胞生物学行为的关系和意义。 为探讨胃腺癌细胞SGC7901在向不同方向诱导分化过程中VLDLR亚型的表达变化与细胞生物学行为之间的关系，本实验在体外，利用全反式维甲酸（ATRA）持续诱导SGC7901细胞建立向高分化诱导变化的模型，利用佛波酯（PMA）持续诱导SGC7901细胞建立向低分化诱导变化的模型；检测端粒酶催化亚单位（TERT） mRNA的表达量判断细胞分化程度。结果显示：SGC7901细胞在ATRA的持续作用下，细胞向高分化转化，Ⅱ型VLDLR明显减少，同时细胞增殖活性和迁移能力逐渐减弱；SGC7901细胞在PMA的持续作用下，细胞向低分化转化，Ⅱ型VLDLR明显升高，同时细胞增殖活性和迁移能力增强。上述结果表明Ⅱ型VLDLR的表达变化与肿瘤细胞分化之间存在相关性。为了深入探讨VLDLR亚型与细胞分化、增殖、迁移等的关系，本实验利用能影响细胞增殖迁移的VLDLR的配体（uPA-PAI-1、TFPI）与细胞温育，观察VLDLR亚型的表达变化与细胞生物学行为之间的关系。实验结果发现：TFPI抑制细胞增殖、迁移的同时可明显减少Ⅱ型VLDLR，对Ⅰ型VLDLR无影响，并可使Ⅱ型VLDLR与Ⅰ型VLDLR的比值逐渐降低；uPA-PAI-1复合物促进细胞增殖、迁移的同时可减少Ⅰ型VLDLR，增加Ⅱ型VLDLR，并使Ⅱ型VLDLR与Ⅰ型VLDLR的比值逐渐升高。 综上所述，我们的结果证实：无论是诱导分化，还是影响细胞增殖相关配体的作用，肿瘤细胞中VLDLR亚型的变化具有如下规律：在低分化、增殖、迁移能力强的细胞中同时伴有Ⅱ型VLDLR增加，在高分化、增殖、迁移能力弱的细胞中同时伴有Ⅱ型VLDLR减少。这一变化规律说明Ⅱ型VLDLR在促进细胞增殖、迁移，抑制细胞分化中扮演着重要角色。 已有的研究表明，VLDLR在神经组织发育过程中，介导Reelin-Dab1信号途径，通过SFK/PI3K-Gsk3b调节细胞骨架蛋白Tau而影响细胞骨架的重构和细胞迁移；在内皮细胞增殖和迁移相关的wnt信号途径中VLDLR发挥重要的负调控作用，表明VLDLR在细胞增殖分化的wnt信号途径中发挥重要调节作用。另外，VLDLR与uPA-PAI-1复合物的结合可维持胞内ERK的磷酸化，从而促进细胞增殖、迁移；而与TFPI结合可通过通过p16ink4a和p38/JNK信号途径抑制细胞的增殖；这些表明VLDLR与不同配体的结合，调节与细胞增殖分化相关的MAPK信号体系中不同的通路，影响截然相反的细胞功能。另有研究表明，ERK的活化可使GSK-3b磷酸化失活，导致b-catenin在胞内聚集，而b-catenin可促进下游包括MMPs在内的特异基因的转录，影响细胞增殖、迁移。这些表明VLDLR与不同配体结合影响细胞功能的信号调节作用可能与MAPK、wnt途径有关。但VLDLR亚型的变化影响细胞生物学行为的机制目前尚不清楚。 根据已有研究我们推测Ⅱ型VLDLR影响细胞增殖、迁移与MAPK、wnt信号通路有关，因此本实验在诱导分化过程中和细胞增殖迁移调控配体的温育下，观察VLDLR可能涉及的信号途径的关键分子的活性及表达变化，初步探讨Ⅱ型VLDLR影响细胞生物学行为的可能机制。实验结果发现：在细胞向高分化诱导过程中和TFPI温育后Ⅱ型VLDLR减少，b-catenin的磷酸化明显增强促进其降解从而使其在胞内表达降低，同时其下游靶基因MMP-2和MMP-9的表达下调，抑制细胞增殖、迁移；而在细胞向低分化诱导过程中和uPA-PAI-1温育后Ⅱ型VLDLR增加，b-catenin的磷酸化受到抑制增加其稳定性从而促进胞内表达上调，同时其下游靶基因MMP-2和MMP-9的表达上调，促进细胞增殖、迁移。因此Ⅱ型VLDLR影响细胞生物学行为变化可能与b-catenin在胞内的表达上调，从而促进特异靶基因的转录有关。 已有研究表明，VLDLR与uPA-PAI-1的结合可维持乳腺癌胞内ERK的磷酸化。我们的实验发现，uPA-PAI-1与细胞温育5 min即可明显增强ERK的磷酸化，这种作用可一直持续到30 min，对ERK1的磷酸化作用在温育60 min后仍较明显。这与前述研究一致。VLDLR与TFPI结合可通过活化p38/JNK信号途径抑制细胞增殖。我们的实验发现，TFPI可抑制ERK的活化。对LDLR表达调控的研究发现，胞外分子可通过激活p38信号途径抑制ERK的活性从而下调LDLR的表达。因此我们推测，TFPI可能通过活化p38从而抑制ERK的活化。上述结果提示，uPA-PAI-1复合物可能通过Ⅱ型VLDLR活化胞内ERK，从而促进细胞增殖、迁移；而TFPI可能通过Ⅰ型VLDLR活化p38从而抑制ERK的活化，从而抑制细胞增殖、迁移。 上述结果提示，Ⅱ型VLDLR影响细胞生物学行为的变化可能与ERK的活化抑制b-catenin的磷酸化降解使其在胞内表达上调，调节特异靶基因的转录有关。 综上所述，Ⅱ型VLDLR可能通过与特定配体的结合、摄取，影响细胞内增殖、分化相关的信号途径，导致相应细胞生物学行为改变。本研究的创新之处在于初步揭示了Ⅱ型VLDLR的表达变化与细胞增殖、分化、迁移之间的关系及其可能涉及的信号转导途径，扩展了VLDLR功能的多样性，并对脂蛋白受体家族成员作为“瑞士军刀”样多功能受体提供了新的认识。