鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集及其机制的研究

摘要

第一部分: 目的：探讨鱼藤酮对多巴胺能细胞的毒性作用及其机制。 方法：采用不同浓度鱼藤酮处理PC12细胞24小时，用噻唑蓝比色法检测细胞活性，Hoechst 33258染色观察细胞核形态，流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞内活性氧水平和线粒体膜电位，比色法检测细胞内谷胱甘肽水平，荧光底物酶活性法检测caspase 3活性；此外，采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸预处理30分钟，检测上述指标。 结果：与正常组相比，10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L和10μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞24小时后，细胞活力和细胞凋亡率呈剂量依赖性下降(P<0.05),其中1μmol/L组MTT吸光度为正常组的42.1％，凋亡率为41.9％。Hoechst 33258染色可见鱼藤酮组具有不同时期凋亡核特征的细胞。鱼藤酮处理后，除10nmol/L组细胞内DHE荧光强度与正常组无显著差异外（P>0.05），余各组细胞内活性氧水平均增高，线粒体膜电位下降及caspase 3活性增高（P<0.05），其变化程度亦呈药物剂量依赖性。谷胱甘肽水平在10nmol/L、100nmol/L鱼藤酮组分别为正常的144％和117％（P<0.05），1μmol/L和10μmol/L组分别下降15％和42％（P<0.05）。N-乙酰半胱氨酸（500μmol/L和2.5mmol/L）预处理30分钟，可部分抑制1μmol/L鱼藤酮所致的上述效应（P<0.05）。 结论：鱼藤酮处理可诱导多巴胺能细胞凋亡，其机制与氧化应激和线粒体膜电位下降有关；而且PC12细胞凋亡率具有鱼藤酮剂量依赖性；采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸预处理，可通过抗氧化应激抑制鱼藤酮的毒性效应，该药物对细胞具有保护作用。 第二部分: 目的：探讨鱼藤酮对多巴胺能细胞α-突触核蛋白表达和聚集的影响。 方法：采用不同浓度鱼藤酮（10nmol/L、100nmol/L和1μmol/L）处理PC12细胞24小时，Western 印迹法检测α-突触核蛋白表达水平；免疫荧光共聚焦法观察胞浆内α-突触核蛋白聚集物的形成，及硫磺素S染料染色初步了解聚集物的结构性质。此外，采用N-乙酰半胱氨酸预处理（在鱼藤酮作用前30分钟开始预处理），与1μmol/L鱼藤酮组比较α-突触核蛋白表达水平有无变化，以及该抗氧化剂对α-突触核蛋白聚集物形成的影响。 结果：Western印迹法显示，鱼藤酮组胞浆内α-突触核蛋白表达水平较正常组显著升高（P<0.05），而且升高的程度呈剂量依赖性；其中，1μmol/L组采用N-乙酰半胱氨酸（500μmol/L）预处理后，α-突触核蛋白表达水平明显下降（P<0.05），但仍高于正常组（P<0.05）。免疫荧光共聚焦结果显示，正常组细胞胞浆内α-突触核蛋白散在分布，1μmol/L鱼藤酮组可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集物形成，呈硫磺素S染色阴性；采用N-乙酰半胱氨酸（500μmol/L）预处理后，聚集物数量减少，体积缩小。 结论：鱼藤酮处理可诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白的表达，促进α-突触核蛋白聚集物的形成；而且上述过程均与氧化应激有关。 第三部分: 目的：探讨鱼藤酮诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白表达上调的机制。 方法：采用不同浓度鱼藤酮（10nmol/L、100nmol/L和1μmol/L）处理PC12细胞24小时及N-乙酰半胱氨酸（500μmol/L）预处理30分钟，实时荧光定量PCR法检测细胞内α-突触核蛋白mRNA水平。于1μmol/L鱼藤酮处理的不同时间点（2、6、12、18、24小时），收集细胞，采用荧光底物酶活性法检测20S三种酶水解活性（胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽基谷氨酰基水解酶）；同时Western印迹法观察α-突触核蛋白表达与时间的相关性。 结果：采用鱼藤酮处理PC12细胞24小时后，α-突触核蛋白mRNA水平较正常组显著升高（P<0.05），升高的程度呈剂量依赖性；1μmol/L鱼藤酮组采用N-乙酰半胱氨酸预处理30分钟，该指标较鱼藤酮组显著下降（P<0.05）。1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞，于2小时20S蛋白酶体酶水解活性开始显著下降（P<0.05），下降的程度具有时间依赖性；而α-突触核蛋白表达水平于6小时开始升高（P<0.05）。N-乙酰半胱氨酸预处理可部分抑制1μmol/L鱼藤酮诱导的蛋白酶体酶活性损伤（P<0.05）。 结论：鱼藤酮可诱导α-突触核蛋白转录水平升高及20S蛋白酶体酶水解活性下降，从而促进α-突触核蛋白表达水平的提高；其机制均与氧化应激有关。 第四部分: 目的：探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮的细胞毒性和α-突触核蛋白聚集过程中的作用。 方法：采用鱼藤酮（1μmol/L）处理PC12细胞，噻唑蓝比色法检测细胞活性，流式细胞术检测DHR123荧光强度（即细胞内活性氧水平）；Western印迹法检测胞浆内α-突触核蛋白表达；免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集物。并采用多巴胺耗竭剂—利血平预处理3小时，观察上述指标。 结果：1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞24小时，导致细胞活力较正常组显著下降（P<0.05），吸光度为0.730±0.01（正常组为1.112±0.025）；利血平（1μmol/L和5μmol/L）预处理后再给予鱼藤酮，孵育24小时后，吸光度分别为0.945±0.02和1.06±0.03，细胞活力较鱼藤酮组显著升高（P<0.05）。鱼藤酮处理24小时，过氧化物水平升高至正常组的281％，而利血平（1μmol/L和5μmol/L）预处理后，分别降至正常组的248％和232％，与鱼藤酮组比较有显著差异（P<0.05）。鱼藤酮处理后，α-突触核蛋白表达水平显著升高，胞浆内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集物形成；采用上述浓度利血平预处理，α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显著下降（P<0.05），α-突触核蛋白聚集物数量减少。 结论：多巴胺介导了鱼藤酮对多巴胺能细胞的毒性作用，并可促进α-突触核蛋白聚集物的形成；对于鱼藤酮选择性损伤多巴胺能细胞的机制具有重要意义。