ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304内吞整合素β1中的作用

摘要

本研究分为二部分：
　　 第一部分：ICAP1α基因及其突变体T38A、I138A真核表达载体的构建和鉴定
　　 目的：构建并鉴定ICAP1α基因及其突变体T38A、I138A真核表达载体。
　　 方法：以pCMV-SPORT6/ICAP1α质粒为模板，通过PCR扩增ICAP1α基因片段，双酶切后再与AAV载体重组连接。同时采用重叠PCR定点突变法构建其突变体pAAV-T38A，pAAV-I138A表达载体。重组质粒经酶切鉴定和DNA 序列测定,筛选出重组pAAV-ICAP1α、pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体。
　　 结果：阳性重组质粒酶切及测序鉴定和比对与预期结果完全相符。
　　 结论：成功构建pAAV-ICAP1α、pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体，可为ICAP1α基因及其突变体T38A、I138A的生物学功能研究提供基因材料。
　　 第二部分：ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304整合素β1内化中的作用
　　 目的：探讨ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304内化整合素β1中的作用和机制。
　　 方法：构建pAAV-ICAP1α及其突变体pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体,转染ECV304，ECV304分为ICAP1α组、T38A组、I138A组、绿色荧光蛋白(GFP)组和未转染组，用可还原的细胞表面生物素(NHS-SS-Biotin)标记整合素β1，并利用生物素-亲和素的特性以及western blot检测整合素β1内化情况。
　　 结果：各组细胞转染的质粒均稳定表达；ICAP1α组、T38A组、I138A组、GFP组、未转染组相对光密度值分别为1.07±0.04、0.68±0.06、0.70±0.02、0.87±0.06、0.88±0.04；与GFP组和未转染组比较，ICAP1α组整合素β1内化明显增多(P＜0.05)；与GFP组、未转染组和ICAP1α组比较，T38A组和I138A组整合素β1内化明显减少(P＜0.05)，GFP组与未转染组无差别(P＞0.05)。
　　 结论：转染ICAP1α后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化增加，而转染T38A和I138A后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化减少；ICAP1α可能通过其关键位点38Tyr和138Ile调控整合素β1的内化。