活化小胶质细胞参与癫痫发病的作用机制研究——IL-1β的重要作用

摘要

小胶质细胞（microglia，MG）广泛分布于中枢神经系统，正常状态下，MG处于静止状态，行使免疫监视功能。前期的研究也曾证实，在临床外科手术切除颞叶癫痫灶的标本中，有大量增生和激活的MG，提示MG与癫痫的发病密切相关。另据报道很多细胞因子与癫痫的发病有关，如IL-1β和IL-6在致痫大鼠大脑皮质及海马内表达增加；而在MG与神经元混合培养的体外实验研究中，用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或干扰素-γ（interferon-γ，ITF-γ）活化的MG与神经元混合培养可加剧神经元损伤，加入IL-1受体拮抗剂（receptor antagonist，IL-1ra）或NMDA受体拮抗剂MK-801后可显著改善这种效应，表明NMDA受体和IL-1受体均参与了MG介导的神经毒性。虽然目前已关注到癫痫的病理机制与MG之间有密切的关系，但在癫痫病程中，活化的MG通过何种途径或物质影响神经元的兴奋性尚未彻底阐明。根据上述提示的研究资料我们推测，活化的MG有可能通过产生和分泌过量的生物活性物质，包括IL-1β，而参与癫痫的病理过程。因此，本研究以海人酸（kainic acid，KA）为激活剂，以美满霉素（minocycline）为抑制MG活化的工具药，以IL-1β抗体或IL-1受体拮抗剂拮抗IL-1β的效应，通过离体和在体实验，模拟癫痫发作时MG的活化状态，探讨MG活化后及所产生的IL-1β在癫痫发生发展中的作用及相关机制，以期为癫痫发病机制研究提供新的实验资料，为抗痫药物研制提示新的作用靶点。本研究共分四个部分。
　　 第一部分、KA对MG的激活作用及与IL-1β产生的关系
　　 为了探讨癫痫状态下MG的活化及与IL-1β产生的关系，本实验先分离纯化培养新生大鼠大脑皮质MG，再以KA 激活MG 或以美满霉素预处理抑制MG的活化，然后应用免疫组织化学方法观察MG特异性标志物OX-42的表达变化；采用Elisa法测定MG条件培养液内IL-1β的含量；采用RT-PCR法检测MG内IL-1βmRNA的表达变化。免疫组织化学结果显示，KA作用MG2h后，MG出现显著的胞体增大、突起回缩的形态学改变，MG内OX-42的免疫反应较正常组和美满霉素+KA组明显增强（P<0.01）。Elisa检测结果显示，MG条件培养液中IL-1β的含量在KA组中明显高于正常组（P<0.01）；而美满霉素+KA组IL-1β的含量则明显低于KA组（P<0.01）。RT-PCR结果显示，MG内IL-1βmRNA的含量在KA组中明显高于正常组（P<0.01）；而在美满霉素+KA组则显著低于KA组（P<0.01）。结果提示，KA对MG有显著的激活作用，激活的MG 产生IL-1β显著增多。MG抑制剂美满霉素能阻遏上述效应。
　　 第二部分、活化的MG条件培养液对大鼠癫痫发作行为学和海马神经元电生理特性的影响
　　 在前面的实验已证实，KA能显著激活MG 并致其产生和分泌IL-1β增多。推测活化的MG有可能通过过量产生的IL-1β而影响神经元的兴奋性进而参与癫痫的发病。为了证实这一推测，本实验取三种培养液:即正常MG条件培养液（UT-MCM）、KA 激活的MG条件培养液（KA-MCM）、用IL-1β抗体预处理的KA-MCM（IL-1 β抗体＋KA-MCM），分别行大鼠侧脑室注射，观察大鼠行为学改变和脑电图的变化；行大鼠海马CA3 区注射，记录其诱发电位的改变；再取上述三组培养液孵育离体培养的海马神经元，以全细胞膜片钳技术检测其钙电流的变化。结果：(1)行为学观察：UT-MCM组大鼠无明显的痫性发作；KA-MCM组大鼠表现为癫痫发作Ⅲ～Ⅳ级；IL-1β抗体＋KA-MCM组大鼠表现为癫痫发作Ⅰ～Ⅱ级。(2)EEG结果证实：UT-MCM行侧脑室注射后大脑皮质EEG 显示为平稳的基础波；KA-MCM组有频发异常高电位脑电波的出现；IL-1β抗体＋KA-MCM组痫性异常放电明显减弱，波幅及频率均较KA-MCM组低。(3)海马诱发电位显示：KA-MCM组海马群峰电位（PS）的相对幅度与UT-MCM组比较显著升高，差异有显著性(P<0.01)；IL-1β抗体＋KA-MCM组PS的幅度较KA-MCM组显著下调（P<0.05)。(4)膜片钳结果显示：KA-MCM组较UT-MCM组电流幅度和电流密度显著增高(P<0.01)，IL-1β抗体＋KA-MCM组电流幅度和电流密度较KA-MCM组显著下降，但仍高于UT-MCM组(P<0.05)。以上结果表明，活化的MG 产生的生物活性物质能够导致癫痫的发生，其机制与增强神经元的兴奋性，增加神经元钙内流有关。而IL-1 β在这一过程中扮演重要的角色。
　　 第三部分、活化的MG条件培养液对大鼠海马神经元iNOS和NMDAR1表达的影响
　　 文献表明，IL-1β对神经元的促兴奋性效应可能不仅通过活化NMDAR和非NMDAR，介导Ca2+内流而产生快速作用，而且还可通过产生其他活性物质或激活有关信号转导通路等多种途径进一步参与神经元兴奋毒性损伤过程。有研究资料提示IL-1β的异常增加产生的促痫效应可能与iNOS、NMDAR的表达增高有关。我们在第二部分实验已经证实，KA激活的小胶质细胞条件培养液能够促进电压依赖性钙通道（VDCC）的开放，引起Ca2+内流致神经元兴奋性增强进而诱发癫痫的发生，那么活化MG 来源的IL-1β是否对神经元内iNOS和NMDAR1 产生影响而参与癫痫的病理过程呢？为了探明这个问题，本实验以三种不同的MG条件培养液即UT-MCM、KA-MCM、IL-1β抗体＋KA-MCM作为刺激因素，分别行大鼠侧脑室注射或孵育离体培养的海马神经元，采用Western Blot 或RT-PCR技术分别检测大鼠海马组织或培养的海马神经元中iNOS和NMDAR1表达的变化。Western Blot结果显示KA-MCM组大鼠海马组织中iNOS和NMDAR1的蛋白表达水平较UT-MCM组显著升高(P<0.01)，IL-1β抗体＋KA-MCM组较KA-MCM组明显减弱(P<0.01)，但仍然高于UT-MCM组(P<0.01)。RT-PCR结果显示，与UT-MCM组相比，培养的海马神经元中iNOS和NMDAR1的mRNA表达在KA-MCM组中显著升高(P<0.01)，而用IL-1β抗体预处理的IL-1β抗体＋KA-MCM组较KA-MCM组则显著下降(P<0.01)。离体海马神经元与在体海马组织中iNOS和NMDAR1的表达变化基本一致。结果提示，KA活化的MG条件培养液中IL-1β能显著上调大鼠海马神经元iNOS和NMDAR1的表达。
　　 第四部分、活化的MG条件培养液对培养的海马神经元氨基酸类神经递质的影响
　　 氨基酸类神经递质学说在癫痫的发作与治疗中占有主导地位，谷氨酸（glutamate，Glu）和γ-氨基丁酸（aminobutyric acid，GABA）分别是脑内最主要的兴奋性和抑制性神经递质，它们广泛地分布于各脑区，二者在功能上协调一致，共同维持着神经元兴奋与抑制的平衡，在代谢上密切相关，并可循环转换。我们在第二部分和第三部分的实验中发现，活化MG 来源的IL-1β参与了癫痫的发生，其机制与Ca2+内流增加，NMDAR1和iNOS表达升高有关，而这三者与Glu和GABA 都有着功能或代谢上的某些联系，提示通过IL-1β介导的活化的MG与神经元之间的相互作用也可能影响神经元Glu和GABA的分泌和产生。因此，本实验用三种培养液:即UT-MCM、KA-MCM、IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）＋KA-MCM分别孵育离体培养的海马神经元，再收集三组神经元培养液，采用高效液相色谱技术检测各组海马神经元Glu和GABA 分泌量的变化。实验发现，与UT-MCM组比较，KA-MCM组Glu的分泌量显著增多(P<0.01)，GABA分泌显著减少（P<0.01)，二者比例失衡。而用IL-1ra 预处理的KA-MCM作用于海马神经元后，则显著减弱海马神经元中Glu的分泌(P<0.05)，增加GABA的分泌(P<0.05)。结果表明，KA活化的MG条件培养液促进Glu的分泌，减少GABA的分泌，使二者比例失调，而IL-1ra对此效应有拮抗作用。
　　 小结：本研究表明，KA对MG有显著的激活作用，激活的MG 产生IL-1β显著增多。用三种不同的MG条件培养液：即UT-MCM、KA-MCM、IL-1β抗体或IL-1ra＋KA-MCM，行大鼠侧脑室注射或孵育培养的海马神经元，电生理研究证实：KA活化的MG条件培养液能够诱发癫痫的发生，产生痫性脑电波，使海马CA3 区诱发电位增强，并可明显增强电压依赖性的钙电流；分子生物学实验证实：KA活化的MG条件培养液能上调NMDAR1和iNOS的表达；生物化学实验证实，KA活化的MG条件培养液可促进神经元Glu分泌，减少GABA的分泌，使二者比例失调。而用IL-1β抗体或IL-1ra 预处理，可显著拮抗上述效应。综上所述，小胶质细胞与神经元之间在癫痫病程中存在着相互作用，共同参与癫痫病理进程，而IL-1β可能是这一事件中的重要媒介物质之一。它可通过影响神经元的电生理活动、信号转导通路相关分子及氨基酸神经递质的分泌等，提高神经元的兴奋性，从而参与癫痫的病理过程。