饮水内毒素含量及内毒素酶免疫传感器的初步研究

摘要

内毒素（endotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，其位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。细菌在存活的状态下不会释放出内毒素，在细菌死亡菌体裂解或者用人工方法破坏细菌细胞的情况下释放出来。内毒素的化学成分主要有脂多糖、蛋白质和磷脂，其毒性成分主要为脂多糖。而不同种属的革兰氏阴性菌的脂多糖分子均是由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A 三部分构成。脂质A是内毒素的主要毒性组分。不同革兰氏阴性细菌的脂质A结构基本相似。
　　内毒素广泛地存在与空气、土壤、水等与人类生活密切相关的环境中，而人体对内毒素极为敏感，极微量（1-5ng/公斤体重）的内毒素就能导致体温升高。
　　 除致热反应之外，内毒素还会引起白细胞数目减少、Shwartzman 反应、内毒素休克、微循环障碍、播撒性血管内凝血等，对人体健康造成不利影响。
　　 饮用水与人群健康紧密关联。目前国外开展了许多水源水、饮用水内毒素污染的调查，国内基本处于空白。了解饮用水生产工艺中各阶段内毒素含量的水平，有助于评价内毒素净化效果，为制定相关标准提供科学依据。
　　 目前内毒素的主要检测方法有：家兔法、鲎试剂法、免疫法、生物传感器法。
　　 现在国内外对内毒素检测大多数是采用鲎试剂法，是现行内毒素检测的“金标准”。鲎试剂法快速、灵敏（0.01-1ng/ml）、操作简便易推广。但是存在不易区分弱阳性和阴性，需要捕杀大量鲎、对边缘样品不易判断和试剂消耗量大等缺点。
　　 其它方法如家兔热原实验灵敏度低、费时，已经逐渐被淘汰；ELISA 耗时少、灵敏度和特异度高、可重复性好、操作简便但是存在试剂消耗量大且对仪器的要求高的不足。
　　 生物传感器是近年来迅速发展起来的快速检测致病因子的一项新技术。此类检测方法具有耗时少、敏感性及特异性高等优点。而酶免疫传感器作为生物传感器技术的一种，将电化学放大作用和免疫电极的特异性结合，使其不仅具有电化学分析的高灵敏性，还具有免疫识别的高特异性。并且酶免疫电极构建方法灵活，体系容易集成化微型化，酶免疫传感器的检测设备相对简单，使用方便，减少人工操作，更加智能化。
　　 本次研究对武汉市水源水、自来水处理工艺流程各阶段的内毒素含量进行了测定，明确了内毒素的污染水平以及处理工艺的净化效果；采用了电沉积法建立快速检测内毒素的新型酶免疫传感器，并对其检测条件的优化以及其性能特点进行了研究和探讨。
　　 第一部分、武汉市自来水处理工艺过程中内毒素的检测
　　 目的：了解湖北省武汉市主要饮用水中内毒素的污染现状以及自来水常规处理工艺对内毒素的去除效果。
　　 方法：于2008年3月，采集以长江为水源的平湖门水厂、以汉江为水源的宗关水厂的净化处理各环节水样进行调查。采用《中华人民共和国药典》2005 版中细菌内毒素鲎试剂检查法的“光度测定法”测定水样中内毒素的含量。
　　 结果：平湖门水厂：长江源水的内毒素含量范围为98.08～104.08EU/ml，末梢水内毒素含量范围为18.03～22.58EU/ml；宗关水厂：汉江源水的内毒素含量范围为84.33～86.94EU/ml，末梢水内毒素含量范围为40.20～44.44EU/ml；两个水厂对内毒素的去除率分别为76.98～82.68％和47.30～53.76％。
　　 结论：自来水处理工艺对内毒素有去除效果，但出厂水内毒素含量仍高于国外水平。
　　 第二部分、内毒素酶免疫传感器的初步研究
　　 目的：建立基于纳米金修饰的内毒素酶免疫传感器。
　　 方法：通过电沉积法以及静电吸附作用和抗原抗体特异性结合反应将内毒素单克隆鼠抗固定在辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠IgG/纳米金修饰的玻碳电极表面，制备用于检测内毒素的酶免疫传感器。之后通过循环伏安法（CV）和恒电位法（CPE）测定在内毒素被固定在玻碳电极表面而造成的电信号的改变，从而进行定量分析。
　　 结果：0.1mol/LPBS(pH7.0)、二甲氨基甲基二茂铁浓度为1mmol/L、H2O2 浓度为0.2mmol/L、温度为37℃的测定条件为合适的测试条件；该条件下，该酶免疫传感器的检出限为0.01Eu/mL，检测线性范围为0.01-100Eu/mL,相关系数为R=0.930，传感器响应电信号2 周后为初值的70％。
　　 结论：该传感器制备方法简单，灵敏度较高。