纳米羟基磷灰石介导靶向端粒酶逆转录酶RNA干扰的肺癌基因治疗的实验研究

摘要

本研究分为四部分：
　　 实验一:端粒酶逆转录酶siRNA表达质粒的构建、转化、抽提及鉴定
　　 目的：制备可供基因转染的端粒酶逆转录酶siRNA表达质粒。
　　 方法：设计靶向hTERT基因干扰序列GCATTCCTGCTCAAGCTGA，合成两条互补的单链DNA，排列次序如下：BamHⅠ酶切位点、正义序列、loop环、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子，Sa1Ⅰ酶切位点以及HindⅢ酶切位点。合成的寡核苷酸退火；采用BamHⅠ以及HindⅢ双酶切pGenesiL-1表达载体，切胶回收线性化载体；退火产物与线性化pGenesiL-1质粒表达载体相连接；构建hTERT-siRNA重组质粒。采用CaCl2法制备感受态菌，将重组质粒转化感受态菌，抽提的重组质粒进行Sa1Ⅰ以及PstⅠ单酶切并行凝胶电泳分析，通过测序鉴定以确定插入的干扰片段的准确性，确认针对hTERT基因的siRNA表达质粒构建成功。用碱裂解法大量抽提，检测质粒的纯度和浓度。
　　 结果：BamHⅠ以及HindⅢ双酶切pGenesiL-1表达载体，电泳可见约4800bp的线性化的质粒条带。重组质粒可被Sa1Ⅰ酶切出一条约400bp的DNA条带，无法被PstⅠ酶切；阴性对照质粒无法被Sa1Ⅰ酶切，能够被PstⅠ酶切出一条约400bp的DNA条带。测序表明目的序列准确地插到预计的位点。五次质粒大量抽提pGenesil-hTERT的A260/A280均在1.8～2.0间，浓度为1.30μg/μl～1.77μg/μl。
　　 结论：设计合成的RNA干扰序列准确地克隆到pGenesiL-1表达质粒中，靶向hTERT基因的siRNA表达质粒构建成功。该载体可为深入研究端粒酶在肿瘤细胞中的作用机制提供新的手段。大量抽提的pGenesil-hTERT纯度和浓度均能满足基因转染的要求。
　　 实验二:纳米羟基磷灰石表面修饰及与DNA的结合
　　 目的：应用多聚赖氨酸表面修饰纳米羟基磷灰石，研究纳米羟基磷灰石表面修饰及与DNA结合的可行性。
　　 方法：采用超声辅助均相沉淀法制备纳米羟基磷灰石。透射电镜观察纳米粒结构。分别在不同pH环境下进行纳米羟基磷灰石 (nHAP)的多聚赖氨酸 (PLL)修饰。检测nHAP及nHAP-PLL的Zeta电位。采用离心后测上清液DNA浓度及核酸酶消化实验考察PLL修饰后的nHAP结合、保护DNA的能力。
　　 结果：透射电镜下nHAP粒径比较均匀，约(15～20)nm×(60～80)nm左右，分散程度良好。nHAP经Na2CO3预处理后在pH 7.4及pH 7.6下可获得较理想的的PLL修饰效果。nHAP的Zeta电位为(－42.4±7.5)mV，nHAP-PLL的Zeta电位为(8.5±1.5)mV，两组比较差异有统计学意义 (P<0.01)。DNA结合及抗核酸酶保护实验显示nHAP-PLL和DNA质量比达20：1时，nHAP-PLL可有效结合并保护相应DNA。
　　 结论：超声辅助均相沉淀法制备的羟基磷灰石为纳米级颗粒，粒径较小且均匀、分散程度良好。纳米羟基磷灰石经Na2CO3预处理后可以进行多聚赖氨酸表面修饰。经多聚赖氨酸表面修饰的纳米羟基磷灰石可以有效结合并保护DNA。
　　 实验三:纳米羟基磷灰石介导人肺癌A549细胞体外基因转染
　　 目的：探讨经多聚赖氨酸修饰的纳米羟基磷灰石介导人肺癌A549细胞基因转染的可行性。
　　 方法：根据实验二的方法配制nHAP-PLL-DNA复合物。实验分为nHAP-PLL组、脂质体组及对照组，分别配制转染复合物并转染A549细胞。荧光显微镜观察EGFP的表达；流式细胞仪检测pGenesiL-1的转染率。
　　 结果：nHAP-PLL组和脂质体组均见EGFP表达阳性的A549细胞，对照组未见EGFP表达阳性的A549细胞；nHAP-PLL组pGenesiL-1转染A549细胞的转染率为(31.8±1.9)%，与脂质体组的转染率 (33.4±3.7)%差异无统计学意义 (P>0.01)，对照组未见转染阳性的A549细胞。
　　 结论：纳米羟基磷灰石经多聚赖氨酸表面修饰后可介导人肺癌A549细胞体外基因转染，有望成为一种新型的基因转染载体。
　　 实验四:纳米羟基磷灰石介导靶向端粒酶逆转录酶RNA干扰对人肺癌A549细胞的影响
　　 目的：探讨纳米羟基磷灰石介导靶向端粒酶逆转录酶RNA干扰对人肺癌A549细胞的影响。
　　 方法：根据实验二的方法配制nHAP-PLL-DNA复合物。实验分为nHAP-PLL组、脂质体组、nHAP组及对照组，分别配制转染复合物并转染A549细胞。四唑盐 (MTT)法测定细胞生长活力；应用RT-PCR及Western Blot检测各实验组A549细胞hTERT mRNA及蛋白表达，TRAP-ELISA检测端粒酶活性；流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　 结果：nHAP-PLL组、脂质体组与nHAP组A549细胞的增殖受到抑制。nHAP-PLL组、脂质体组与nHAP组细胞增殖较对照组差别有统计学意义 (P<0.05)；nHAP-PLL组抑制细胞增殖较脂质体组及nHAP组明显，差别均有统计学意义 (P<0.05)。各组的hTERT mRNA、蛋白表达及端粒酶活性的变化趋势与A549细胞的增殖情况检测结果一致。流式细胞仪检测nHAP-PLL组、脂质体组、nHAP组及对照组细胞凋亡率分别是(28.1±1.4)%，(19.2±1.3)%，(10.9±1.2)%与 (0.3±0.2)%。nHAP-PLL组、脂质体组及nHAP组均能诱导A549不同程度细胞凋亡，凋亡率与对照组差别有统计学意义 (P<0.05)；nHAP-PLL组细胞凋亡较脂质体组及nHAP组明显，差别均有统计学意义 (P<0.05)。
　　 结论：纳米羟基磷灰石可诱导人肺癌A549细胞凋亡。人肺癌A549细胞端粒酶逆转录酶高表达，端粒酶逆转录酶可成为抑制A549的理想靶点。纳米羟基磷灰石本身具有抑制A549细胞的作用，又能有效地保护DNA并介导A549细胞靶向端粒酶逆转录酶的RNA干扰，使之在肺癌基因治疗领域具有重要的应用价值。