LRIG2对胶质母细胞瘤细胞系GL15生物学特性的影响及其分子生物学机制研究

摘要

本研究分为三部分：
　　 第一部分：富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白2--胶质瘤细胞表皮生长因子受体信号网络新的调控靶点
　　 目的：确定富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白2(LRIG2)是胶质瘤细胞系GL15中EGFR信号通路新的调控靶点。
　　 方法：培养胶质瘤细胞系GL15细胞，经表皮生长因子(EGF)100ng/ml,AG1478 10μM,放线菌酮 (CHX)10μg/ml体外干预后，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot测定LRIG2 mRNA和蛋白表达的时间效应变化。
　　 结果：RT-PCR结果显示随着EGF作用时间的延长，LRIG2 mRNA先上升后恢复至正常水平。Western blot结果显示EGF作用后，表皮生长因子受体(EGFR)，磷酸化EGFR(pEGFR)均先上升后下降，LRIG2蛋白先下降，在30min时上升，120min下降至原水平的50%。CHX作用1.5h后，再加入EGF刺激，可见LRIG2蛋白60min降至原水平的50%。而AG1478作用1h后，再用EGF刺激，EGFR未受明显影响，pEGFR被明显抑制，LRIG2蛋白水平变化不明显。
　　 结论：EGFR活化后可导致LRIG2 mRNA表达上升，LRIG2蛋白合成增加。LRIG2为胶质瘤细胞表皮生长因子受体信号网络一个新的调控靶点。
　　 第二部分：LRIG2基因短发夹RNA表达稳定株的建立及下调LRIG2对EGFR信号通路的影响
　　 目的：构建针对LRIG2基因的短发夹RNA(shRNA)的表达载体，建立稳定转染的细胞株,观察目的基因表达的变化及其对EGFR信号通路的影响。
　　 方法：根据GenBank中LRIG2基因序列设计2条RNA干扰序列，命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2，同时设计1条非特异性序列作为阴性对照。据此设计合成各自的寡核苷酸链，退火后连接入pGenesil2载体，转化扩增后进行序列测定。用不同浓度的G418作用于GL15细胞，得到G418对于GL15细胞的筛选浓度。3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞，用G418筛选后挑单克隆后扩增获得稳定株。逆转录RT-PCR和Western印迹法分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG2的表达。用表皮生长因子(EGF)100ng/ml体外干预得到的稳定细胞株，Western Blot测定EGFR和磷酸化EGFR水平的变化。
　　 结果：3种重组表达载体(pGenesil2-LRIG2-shRNA1、pGenesil2-LRIG2-shRNA2和pGenesil2-negative shRNA)经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确。G418对于GL15细胞的筛选浓度为600μg/ml，筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞，转染 pGenesil2-LRIG2-shRNA2组细胞LRIG2 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative shRNA组，pGenesil2-LRIG2-shRNA1组LRIG2蛋白无明显变化。EGF刺激5分钟和30分钟后，pGenesil2-LRIG2-shRNA2组细胞EGFR和pEGFR蛋白水平均低于对照组。
　　 结论：成功构建了针对LRIG2基因的shRNA表达载体(pGenesil2-LRIG2-shRNA2)，转染细胞后可抑制LRIG2基因表达，LRIG2与LRIG1作用相反，下调LRIG2可减少EGF诱导的EGFR磷酸化，促进EGFR降解。
　　 第三部分：RNA干扰LRIG2后对胶质瘤细胞生长、细胞周期、凋亡、黏附和侵袭能力的影响
　　 目的：研究RNA干扰LRIG2基因表达后对胶质瘤细胞生长、细胞周期、凋亡、黏附和侵袭能力的影响。
　　 方法：MTT法检测稳定转染对照组和siRNA组细胞的增殖，流式检测细胞周期和细胞凋亡，细胞黏附实验检测细胞黏附能力，Transwell检测细胞侵袭能力，免疫细胞化学检测PCNA阳性细胞和LRIG2的细胞定位。
　　 结果：MTT结果显示siRNA组细胞增殖率低于对照组。对照组PCNA阳性细胞率为72%，siRNA组为16%（p<0.01）。细胞周期分析表明对照组G0/G1期，S期和G2/M期分别为60.18%±5.00%，24.22%±5.37%和15.6%±1.54%，siRNA组为82.40%±2.47%，9.41%±1.87%和8.17%±1.01%（p<0.01），siRNA组自发性凋亡增加3倍。LRIG2 RNA干扰组黏附和侵袭能力高于对照组。LRIG2在GL15细胞中主要分布于胞浆。
　　 结论：RNA干扰GL15细胞LRIG2表达后，抑制细胞增殖和使细胞周期阻滞在G0/G1期，凋亡增加，黏附和侵袭能力增强。下调LRIG2可抑制胶质瘤细胞的生长，有望成为胶质瘤分子治疗的靶点。