褪黑素对体内体外高脂诱导胰岛素抵抗的预防作用及机制研究

摘要

2型糖尿病的发病主要是在遗传基础上综合多种环境因素的结果，其中高糖高脂饮食是一种重要的环境因素。2型糖尿病的主要临床特征是胰岛素抵抗及胰岛β细胞分泌功能异常，其中胰岛素抵抗是致病的主要因素，贯穿于其发生、发展的整个过程。
　　 已知肥胖所致的血浆游离肪酸浓度(FFA)增高是引起胰岛素抵抗和的重要危险因素之一。流行病学调查和实验室研究表明，饮食中脂肪摄入过多或脂肪过量储存（肥胖）均可导致胰岛素抵抗，血浆游离脂肪酸（FFA）浓度与肥胖、2型糖尿病等多种胰岛素抵抗状态相关，血浆升高的FFA是导致胰岛素抵抗的决定性因素，也是胰岛素抵抗脂毒学说的重要内容。
　　 肝脏是机体调节葡萄糖代谢和脂代谢的重要器官，有研究发现FFA 能促进肝脏葡萄糖输出,降低肝脏对胰岛素的敏感性，诱导肝脏胰岛素抵抗。肝脏是胰岛素作用的一个重要靶器官，肝脏中胰岛素信号转导途径的缺陷，会直接关系到全身胰岛素抵抗的发生和2型糖尿病的发病，因此对肝脏胰岛素抵抗发生机理和预防的研究已越来越受到人们的重视，随着研究不断的深入，将有利于我们进一步了解2型糖尿病的发病机理，并探寻早期预防方法。
　　 营养过剩和体力活动减少导致细胞内葡萄糖和游离脂肪酸升高，线粒体的能量转换加快，自由基（ROS）的生成增加导致细胞氧化还原状态失衡，使细胞产生氧化应激。许多证据显示，氧化应激参与了胰岛素抵抗的形成，氧化应激也是糖尿病各种慢性并发症的共同基础，是2型糖尿病的重要致病因素。提高机体的抗氧化能力应该可以对抗高血糖和高游离脂肪酸的这种作用。
　　 L02细胞源于人胚胎肝细胞，保留了原代肝细胞的许多基本表型和功能，包括细胞膜成分、代谢通路、生理浓度的各种酶以及活性基因表达，是很好的研究肝脏代谢和胰岛素信号传导的体外实验模型。
　　 本课题体外实验以L02细胞为研究对象，用饱和脂肪酸软脂酸(palmitate,PA)和多不饱和脂肪酸亚油酸（Linoleic acid，LA）孵育L02细胞，诱导L02细胞胰岛素抵抗。为观察FFA对胞内胰岛素信号通路的影响，对胰岛素信号传递的主要蛋白如胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物IRS1/2、蛋白激酶B(PKB)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、S6K、FOXO1等的活性变化进行检测；为观察FFA对细胞内抗氧化防御体系的影响，对细胞内活性氧ROS 水平以及ROS活化的氧化应激敏感激酶c-Jun 氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase）JNK活性进行测定；在PA 孵育同时加入褪黑素（melatonin），一种体内最强抗氧化作用的自由基清除剂，测定以上同样指标，观察褪黑素是否能影响胰岛素信号的传递而改善胰岛素抵抗；并分析褪黑素对L02细胞形成胰岛素抵抗的预防作用及其机制。在体内动物实验以SD大鼠为研究对象，高脂饮食诱导形成大鼠胰岛素抵抗模型，同时每天腹腔注射给予褪黑素，通过检测血脂、血糖、血胰岛素、血和肝脏中氧化及抗氧化指标，以及鼠肝中以上多种信号蛋白、激酶的活性变化，观察分析高脂饮食诱导大鼠氧化应激和全身胰岛素抵抗的关系以及褪黑素的预防作用和机制，为临床上有效的预防和治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病奠定理论基础和提供实验依据。
　　 第一部分：褪黑素对脂肪酸诱导L02细胞氧化应激和胰岛素抵抗的预防作用及机制研究
　　 目的：探讨褪黑素（Melatonin，MT）对软脂酸（Palmitic acid，PA）和亚油酸（Linoleicacid，LA）引起L02细胞氧化应激和胰岛素抵抗的预防作用及其可能机制。
　　 方法：培养L02细胞，分别设立对照组(BSA组)、软脂酸组（PA组）、亚油酸组（LA组）组、软脂酸+褪黑素组（PA+MT组）、软脂酸+维生素C组（PA+VitC组）。各组药物浓度和孵育时间根据不同的实验需要来确定。用荧光比色法测定各组细胞胞内活性氧ROS 水平，Western-blotting 技术检测胰岛素刺激15min后胞内胰岛素信号蛋白磷酸化水平，包括Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A、p-S6K 以及应激敏感激酶p-JNK的磷酸化水平。
　　 结果：用不同浓度（0.1mmol/L，0.3mmol/L，0.5mmol/L）的饱和脂肪酸PA和不饱和脂肪酸LA 处理L02细胞24h，细胞内ROS 生成量呈现明显的浓度依赖关系，且0.3mmol/L和0.5mmol/L PA诱导生成的ROS 大于同样浓度的LA的ROS 生成量，差异有显著意义（P<0.05）；用0.3mmol/L的PA和LA 处理L02细胞不同时间（2h，6h，12h，24h，36h），细胞内ROS 生成量存在明显的时间依赖关系，在24h 达到最高，并在36h后仍维持较高水平（P<0.05）；用0.3mmol/L的PA 孵育L02细胞24h，在加PA的同时分别在培养基中加入终浓度为10μmol/L的MT和1mmol/L的维生素C（VitC），与对照BSA组相比，PA组的ROS含量明显升高（P<0.05）；PA+MT组ROS 生成量明显低于PA组（P<0.05）；PA+MT组与对照BSA组相比，ROS含量没有显著差异（P>0.05）。PA+Vit C组与PA组相比，ROS的生成量减少，但仍高于PA+MT组，差异有显著意义（P<0.05）；在BSA对照组、0.3mmol/L PA 处理组、0.3mmolPA+10umol/L MT处理组细胞培养24h后，PA组和PA+MT组与BSA组相比，磷酸化水平减少的有Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A，磷酸化水平升高的是p-S6K和p-JNK；PA+MT组与PA组相比，使Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A 磷酸化水平显著升高，明显降低了p-S6K和p-JNK 磷酸化水平，组间均差异有显著意义（P<0.05）。
　　 结论：游离脂肪酸导致细胞内ROS增加，MT 能够清除PA 产生的过量的ROS。MT 通过降低活性氧，减少JNK的活化，改善胰岛素信号传递损伤，对PA诱导的胰岛素抵抗具有预防作用。
　　 第二部分：褪黑素对高脂饮食大鼠胰岛素抵抗的预防作用及其机制研究
　　 目的：研究褪黑素对高脂饮食诱导大鼠肝脏及全身胰岛素抵抗的预防作用及其机制。
　　 方法：将230-260 克24只成年雄性Wistar 大鼠随机分为3组，每组8只：正常组，高脂组，高脂+褪黑素组即预防组，饲养10 周。正常组：喂以基础饲料；高脂组：喂以高脂饲料；预防组：喂以高脂饲料的同时，按0.5mg kg-1.d-1 剂量腹腔注射褪黑素，其它各组注射等量的含1%乙醇的生理盐水。实验结束时，大鼠禁食12 小时后测量基础状态下体重，进行口服葡萄糖耐受实验，测定血清空腹胰岛素、血糖、甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸、高密度脂肪酸胆固醇、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。大鼠腹腔注射胰岛素（6U/kg），15min后断头处死，取肝脏，测定肝脏MDA含量、SOD、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）酶活性，RT-PCR检测肝脏PEPCK、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）mRNA水平，Western-blotting 技术检测肝脏胰岛素信号蛋白磷酸化水平，包括Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A、p-S6K以及应激敏感激酶p-JNK的磷酸化水平。
　　 结果：高脂组和预防组与正常对照组比较，体重、脂体比、血胰岛素、游离脂肪酸、总胆固醇、甘油三酯、胰岛素抵抗指数、血和肝MDA、肝PEPCK活性和mRNA 水平、肝G-6-Pase mRNA 水平显著升高（P<0.05），血高密度脂蛋白胆固醇、血和肝SOD水平、胰岛素敏感指数明显下降（P<0.05）；预防组和高脂组比较，体重、脂体比、游离脂肪酸、总胆固醇、甘油三酯、胰岛素抵抗指数、血和肝MDA、肝PEPCK活性和mRNA 水平、肝G-6-Pase mRNA 水平显著降低（P<0.05），血高密度脂蛋白胆固醇、血和肝SOD 水平、胰岛素敏感指数明显升高（P<0.05）。高脂组和褪黑素预防组与对照组相比，肝中信号蛋白磷酸化水平明显减少的有Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A，磷酸化水平显著升高的是p-S6K和p-JNK；褪黑素预防组与高脂组相比，使Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A 磷酸化水平显著升高，明显降低了p-S6K和p-JNK 磷酸化水平，组间差异均有显著意义（P<0.05）。
　　 结论：褪黑素明显改善了高脂大鼠的血脂、血糖和体内的抗氧化防御体系和胰岛素敏感性，增强肝脏胰岛素信号传导能力，显著预防高脂饮食诱导大鼠肝脏和全身胰岛素抵抗。