重型肝炎相关基因的RNA干扰质粒的构建及其体内外干预效应的研究

摘要

背景及目的:
　　 HBV感染在全世界范围的流行都非常严重，尤其是在发展中国家和亚太地区，我国是HBV感染高发地区，人群携带率高达约10～20%。在亚洲，重型肝炎最主要是由HBV感染引起的，而在欧美国家重型肝炎主要是由酒精性肝炎和药物性肝炎引起。重型肝炎是急骤发生广泛性肝细胞坏死而引起重度肝功能障碍，出现以肝性脑病为主的肝功能衰竭症状之高危疾病。该病病情严重，发展迅猛，发病机制尚不明了，临床缺乏上特异、有效的治疗靶点和干预手段，除非实施紧急肝移植，绝大部分患者预后不良。因此探索重型肝炎肝细胞死亡机制，并开发针对其发病机制、阻断病理衍变过程的基因治疗手段正在成为该领域的研究热点和发展方向。
　　 肝细胞过度凋亡引起的肝损伤可以引起肝衰竭，并在多种肝病的发生过程中起重要作用。在生理状态下发生的凋亡主要是清除那些损伤的和多余的细胞,凋亡小体的吞噬不伴随炎症反应的发生。而在病理状态下，肝细胞凋亡则有可能引起炎症反应,出现中性粒细胞的浸润、肝星状细胞活化,发生肝脏纤维化。在重型肝炎的发病过程中，Fas与TNFα系统的激活会促进肝细胞凋亡的发生。肝细胞的凋亡途径包括胞膜上死亡受体介导的外部途径和线粒体介导的内部途径，肝细胞膜上表达最广泛的死亡受体是CD95 (APO21PFas)和TNF2a 受体1 (CD120a)。多项研究表明,急慢性肝病中肝细胞的凋亡一般由死亡受体介导。肝细胞对CD120a和CD95介导的凋亡具有高度的敏感性。体外实验也证实了这一点。在LPS+D-GalN诱导的爆发性肝衰竭模型中，LPS的毒性实际上是由于严重的凋亡性肝损伤和肝细胞完全破坏所引起的。然而，有关肝细胞凋亡在MHV-3诱导的小鼠重型肝炎肝衰竭中的重要作用还未见相关文献报道，因此研究肝细胞凋亡及其调控机制对重型肝炎肝损伤发生机理的理解具有重要意义。TNFα是一种由巨噬细胞产生的细胞因子。TNFα对不同的细胞类型发挥各种不相同的作用，在许多重要的病理和生理过程下作为一重要的介质存在。而且TNFα
　　 还是凋亡的重要介质之一,TNFα的大多数生物学效应TNFR1介导。TNFR1 胞内区含死亡结构域，可引起细胞凋亡或者通过激活核转录因子NF-KB 使某些细胞增殖、分化，另外也可触发信号传导级联而导致细胞凋亡。
　　 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指特异性针对目标基因的同源双链RNA(double-strain RNA，dsRNA)的导入引起目的基因不表达或减效表达，具有高效、特异，快速等优点，应用前景广阔。前期研究发现通过尾静脉高压注射可以使质粒DNA在小鼠肝脏高效表达。尾静脉高压注射可将大体积的裸质粒DNA 溶液经小鼠尾静脉快速注入，大量的质粒溶液导致循环血量的急剧增加，超过心脏负荷，血液积聚在肝窦中不能回流，延长了质粒DNA 在肝窦中的停留时间，从而被肝组织细胞摄取。因此该方法可以广泛应用于肝脏疾病基因干预的研究。从基因水平沉默“有害”高表达的基因可以更好地阐明该基因在疾病的发生发展中重要作用，也为探索人类重型肝炎临床治疗方法提供新的思路和手段。
　　 具体研究目的如下：
　　 1. 针对重型肝炎发病关键基因mTNFR1 构建siRNA干扰质粒，在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中可以明显抑制TNFR1基因的表达。
　　 2. 研究mTNFR1shRNA干扰质粒对重型肝炎小鼠体内mTNFR1表达的抑制，改善肝细胞的凋亡情况，生化指标以及对小鼠重型肝炎病情发展的影响。
　　 3. 针对凋亡相关基因Fas，TNFR1 构建其真核表达载体和microRNA表达载体，并研究在miRNA 在细胞水平对基因表达的抑制作用。
　　 方法:
　　 1. 构建mTNFR1shRNA干扰质粒和非相关对照质粒，细胞水平分别共转染mTNFR1shRNA干扰质粒和pEGFP-TNFR1，mTNFR1shRNA干扰质粒和pCDNA3.0-TNFR1，并通过显微镜下观察荧光，RT-PCR、Western blot 技术检测mTNFR1shRNA干扰质粒的体外干预效应。
　　 2. 采用MHV-3感染Balb/cJ小鼠制造重型肝炎动物模型；通过尾静脉高压注射将目的基因导入小鼠肝脏，并检测目的基因在肝脏的表达效率；mTNFR1shRNA干扰质粒高压注射后，检测小鼠肝组织病理、血清生化学变化，并观察重型肝炎小鼠生存率的改变；通过Real-time PCR、免疫组化检测mTNFR1shRNA干扰质粒干预后的小鼠肝脏mTNFR1的表达情况；用TUNNEL法检测肝细胞凋亡情况的改变，并计算凋亡指数。
　　 3. 构建人类Fas和TNFR1基因的真核表达载体及其miRNA表达载体，并将其共转染至人293T细胞，通过Real-time PCR和western blot检测在细胞水平对基因表达的抑制作用。
　　 结果:
　　 1. 成功构建mTNFR1shRNA干扰质粒和非相关对照质粒，并鉴定无误；分别共转染mTNFR1shRNA干扰质粒和pEGFP-TNFR1，mTNFR1shRNA干扰质粒和pCDNA3.0-TNFR1至CHO细胞，镜下可见干预后荧光明显减弱，RT-PCR、Western blot结果证实mTNFR1shRNA干扰质粒细胞水平显著抑制mTNFR1的表达。
　　 2. 尾静脉高压注射可以将目的基因导入小鼠肝脏，24h 重复注射可以使表达效率提高到40%。mTNFR1shRNA干扰质粒高压注射后，重型肝炎小鼠生存率从0 提高到13.3%，并显著改善肝组织病理学变化和血清学指标；mTNFR1shRNA干扰质粒高压注射后，显著抑制mTNFR1 在重型肝炎小鼠模型体内的表达，并显著减少肝细胞的凋亡。
　　 3. 成功构建人类凋亡相关基因Fas，TNFR1的真核表达载体和miRNA干扰质粒，并鉴定无误；Fas-miRNA和TNFR1-miRNA干扰质粒在细胞水平显著抑制hFas和hTNFR1的表达。
　　 结论:
　　 1. 本研究利用在线软件设计合成针对小鼠TNFR1基因的RNA干扰靶序列，通过PCR将其连接于 pMSCV-U6 载体，并通过序列鉴定无误。构建成功的的mTNFR1shRNA干扰质粒通过转染CHO细胞，体外实验证实可以有效且特异地下调目的基因的表达。
　　 2.建立MHV-3诱导的重型肝炎小鼠模型，并通过尾静脉高压注射技术将外源基因高效导入小鼠肝脏，mTNFR1shRNA干扰质粒通过下调小鼠肝脏TNFR1基因的表达可以显著提高小鼠的生存时间和生存率，并且生化指标和肝脏的炎症均得到明显改善。为今后重型肝炎、肿瘤、代谢性疾病等凋亡相关的疾病治疗提供了一条新途径。
　　 3. 重型肝炎的肝细胞死亡机制主要包括肝细胞的过度凋亡，因此基因治疗的靶点需包含与肝细胞凋亡相关的多个关键基因。本研究构建了凋亡相关基因Fas和TNFR1真核表达质粒和microRNA干扰质粒，通过转染至人293T细胞，在体外试验中有效且特异得下调目的基因的表达。