柯萨奇-腺病毒受体在宫颈癌细胞恶性表型中的作用及机制研究

摘要

宫颈癌是严重危害我国妇女健康的重要疾病之一。我国是仅次于智利的宫颈癌第二高发国家，每年新发病例约 13.15万，占全世界新发病例的 28.7[％]，死亡率占世界三分之一。现已公认超过 99[％]的宫颈癌与高危型 HPV 感染有关，但高危型 HPV 感染患者中仅有少数发展为宫颈癌。患者感染HPV后，从发生宫颈癌前病变进展到原位癌、浸润癌并形成转移的过程，以及局部微环境对肿瘤发生发展调控的关键分子机制尚不清楚。虽然目前国际上已开发出针对HPV的宫颈癌的预防性疫苗，但此预防性疫苗仅能通过接种尚未发生感染的人群来降低 HPV 感染率，而对已感染 HPV的人群无效。因此，在有效治疗高危型 HPV 感染的手段尚未建立之前，寻找宫颈癌发生和进展的分子学基础并进行分子干预和逆转，对保护已被 HPV 感染或已发生癌前病变的妇女具有重要的现实意义。
　　 恶性肿瘤的发生发展涉及多种细胞生物学行为的参与，其中细胞间以及细胞与基质的黏附对细胞恶性表型有决定性的作用。已知整合素(Integrin)、钙连接素(Cadherins)等黏附分子能通过肿瘤细胞与宿主正常细胞间的相互作用参与肿瘤发生的众多生物过程，如信号转导、浸润、转移、抗凋亡等。最近发现的新型黏附分子中，柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackie and Adenovirus Receptor，CAR)是引起最多关注的一个。CAR 最早作为腺病毒的受体而被认识，因为腺病毒载体基因治疗的兴起而备受重视，后被发现具有复杂的生物学功能。综合目前文献，有关 CAR 功能的探讨集中在三个方面：(1)作为病毒受体介导腺病毒和柯萨奇病毒吸附感染靶细胞；(2)作为细胞黏附分子参与细胞黏附及细胞运动，胞外域介导同型细胞间黏附；新近有文献报道，肿瘤细胞的迁移与 CAR和微管之间的相互作用有关；(3)作为膜受体通过包括 p21、pRb的下游信号抑制分子引发细胞的生长抑制信号，从而参与细胞间的接触抑制，并抑制肿瘤细胞的生长。在临床肿瘤组织中，CAR的表达模式与 E-Cadherin 类似：原发灶中表达下调，导致肿瘤细胞的迁出；在转移灶，细胞表面再次表达则导致其黏附到转移部位的组织。该现象提示 CAR在肿瘤侵袭转移过程中有非常重要的作用。目前研究发现CAR与多种肿瘤的恶性表型相关，但对其在宫颈癌发生发展中的作用目前还少有报道。
　　 本研究将对CAR 作为黏附分子在宫颈癌从癌前病变发展到浸润癌、并形成转移灶过程中的作用机制进行初步探讨。通过上述研究，试图阐明以下几个方面的问题：1)结合体内和不同临床发展阶段宫颈病变(从慢性宫颈炎到癌前病变、原位癌以及浸润癌)标本的验证说明CAR与宫颈癌发生发展的关系；2)在体外进一步通过在低表达CAR的宫颈癌细胞株SiHa中转染全长CAR真核表达载体，研究转染后细胞恶性表型的变化，探讨CAR在宫颈癌侵袭转移过程中的可能机制。
　　 第一部分：柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackie and Adenovirus Receptor，CAR)在宫颈病变组织中的表达及意义
　　 背景与目的：
　　 柯萨奇-腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor，CAR)最早作为腺病毒受体而被广泛研究。研究表明CAR是一种具有复杂生物学功能的细胞间粘附分子，已被证实与多种肿瘤的发生和转移有关，但具体作用机制还不清楚。本文通过研究CAR在宫颈病变组织中的表达及意义，探讨其在宫颈癌形成和演进过程中的可能作用。
　　 方法：
　　 采用免疫组织化学方法检测不同临床发展阶段的宫颈病变中CAR的表达情况。通过对10例正常宫颈组织、40例慢性宫颈炎组织、40例宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和40例宫颈原位癌以及浸润癌组织中CAR表达水平差异的比较，分析CAR表达与宫颈癌发生发展的关系。
　　 结果：
　　 与正常宫颈组织和CIN相比，宫颈癌组织CAR的表达普遍下调(P<0.001)，但CAR在原位癌和浸润癌的表达水平并无明显差异(P=0.02)；CAR的表达水平与肿瘤组织类型相关。
　　 结论：
　　 在绝大多数宫颈癌组织中存在CAR表达下调；CAR表达变化与宫颈癌灶的组织类型相关，可以作为监控宫颈癌发生、发展及临床转移的重要生物学指标，其具体作用机制值得进一步研究。
　　 第二部分：CAR转染逆转宫颈癌细胞株SiHa恶性侵袭表型的体外研究
　　 背景与目的：
　　 柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackie and Adenovirus Receptor，CAR)最早作为2型和5型腺病毒的受体而被认识和广泛研究。研究表明CAR是一种具有复杂生物学功能的细胞间粘附分子，已被证实与多种肿瘤的发生和转移有关，但具体作用机制尚不清楚。本研究通过在低表达CAR的宫颈癌细胞株SiHa中转染全长CAR真核表达载体，研究转染后细胞恶性表型的变化，探讨CAR在宫颈癌侵袭转移过程中的可能机制。
　　 方法：
　　 利用流式细胞术检测4株宫颈癌细胞株中CAR的表达，构建并扩增CAR全长真核表达质粒，脂质体介导转染全长CAR真核表达质粒及空载体至低表达CAR的细胞株，经G418筛选出稳定表达的阳性细胞克隆，分别命名为SiHa-CAR和SiHa-TOPO利用Western blot和Realtime-PCR检测转染前后细胞中CAR蛋白表达的变化；通过体外划痕愈合试验、体外黏附实验，Transwell试验、细胞骨架变化验证CAR对宫颈癌细胞株侵袭表型的影响。
　　 结果：
　　 流式细胞术的结果显示，在被检测的4株宫颈癌细胞株中SiHa细胞的CAR表达最低；Western blot和RealTime-PCR结果提示，与转染空载体及未经任何处理的SiHa细胞相比，转染全长CAR真核表达质粒后，SiHa细胞中CAR mRNA及蛋白质的表达水平明显增高；体外黏附实验显示，与对照组相比较，SiHa/CAR细胞间的黏附能力明显升高，而被FN黏附的细胞较对照组少；划痕实验中，与SiHa细胞相比，在24h内，SiHa/CAR细胞运动能力明显减弱，而SiHa细胞在24h已愈合;速率分别为SiHa10.3±2.1，SiHa/CAR4.7±1.0(P<0.05)；transwell结果发现与对照组相比，SiHa/CAR的细胞穿出的明显少；细胞骨架染色后SiHa/CAR细胞的形态和细胞骨架也发生了变化，对照组SiHa细胞骨架在细胞周围增多，且呈现出一定的极性，而SiHa/CAR细胞骨架的排列由周围向中央转移，沿胞膜分布减少；细胞的体外侵袭转移能力明显降低，细胞体外侵袭表型得到一定逆转。
　　 结论：
　　 外源性CAR基因的导入可以通过增加宫颈癌细胞株SiHa细胞间的黏附性从而抑制肿瘤细胞的侵袭转移表型。CAR的表达水平与宫颈癌的侵袭转移能力密切相关。