TSA上调食管癌EC9706柯萨奇腺病毒受体表达的研究

摘要

研究背景
　　 腺病毒作为溶瘤病毒或基因治疗的载体已被广泛用于恶性肿瘤的治疗,随着对腺病毒生活周期的认识水平的提高,可以通过遗传工程使其改造,使之特异性裂解肿瘤细胞而不对正常细胞产生作用,并且具有溶细胞复制周期的特性和特异靶向肿瘤细胞的功能。溶瘤病毒用于肿瘤的治疗已经有近60年的历史,已有大量的研究对病毒的改造,给药途径探索,疗效观察,机制及危险性等各方面进行了广泛深入的探讨,使人们对溶瘤病毒的认识有了很大发展。随着医学技术的日新月异和基因工程研究的不断发展,溶瘤病毒有望成为治疗肿瘤的重要武器。而柯萨奇病毒腺病毒受体(Coxsackie-adenovirus receptor CAR)作为腺病毒进入细胞的一个主要受体,在不同细胞表面的表达水平直接影响病毒入胞及其后所产生的一系列生物学效应,它不仅在正常细胞表面的表达各异,而且在不同肿瘤细胞上的表达存在很大差异。这些研究结果提示对不同肿瘤细胞表面受体丰度进行研究,可预测细胞对腺病毒的敏感性及治疗效应,这对指导治疗预测疗效及不良反应的预防等都具有重要价值。因此国内外都在积极研究各种肿瘤细胞CAR的表达丰度和对基因工程腺病毒抗瘤活性的影响,期望找到合适方法提高CAR的表达量。
　　 研究目的
　　 研究食管癌鳞癌EC9706细胞CAR的表达情况,探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(trichostatinA,TSA)抑制食管癌EC9706细胞周期及诱导凋亡的作用,看能否上调食管癌EC9706柯萨奇.腺病毒受体表达；探讨HDAC抑制剂在腺病毒载体基因治疗中应用的可能性和作用机制。
　　 研究方法
　　 用免疫细胞化学、免疫荧光、Westernblotting、Rt-PCR检测食管癌EC9706细胞CAR的表达；
　　 用MTT生长抑制实验找出最适TSA作用浓度作用于EC9706；再利用流式细胞仪检测细胞周期；利用Westernblot检测食管癌细胞周期相关基因P21、P27的表达；用AnnexinV-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,利用Westernblot检测食管癌细胞凋亡相关基因bax、bcl-2的表达；
　　 用免疫细胞化学、免疫荧光、Westernblotting、流式细胞术、Rt-PCR.检测TSA作用后食管癌EC9706细胞CAR的表达水平；
　　 应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差((X)±S)表示；两组均数的比较用t检验(t-test),两组以上均数的比较用方差分析(ANVOA)。检验水准均设定为a=0.05。
　　 实验结果
　　 食管癌EC9706细胞CAR的表达水平低下,与对照组H ela细胞比较表达率仅有20％(p<0.05)；
　　 1.0μmol/L浓度的TSA对EC9706细胞有明显的生长抑制作用,并呈现一定的量效关系,在1.0μmol/L浓度之上的TSA可明显诱导食管癌细胞EC9706细胞周期阻滞,可明显增强EC9706细胞的P21、P27基因的表达；1.0μmol/L浓度的TSA诱导EC9706细胞凋亡率明显增加(p<0.05),且呈浓度依赖性,1.0μmol/L浓度的TSA作用48h、72h后,细胞凋亡率明显增加(p<0.05),且呈时间依赖性,Westernblotting检测TSA处理的EC9706细胞发现,与细胞凋亡相关的基因Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少；0.51μmol/L浓度的TSA可以上调EC9706细胞CAR的表达,并具有浓度依赖性。(p<0.05)
　　 结论
　　 EC9706细胞CAR表达与H ela细胞相比,明显低下。
　　 一定浓度的TSA可以抑制食管癌EC9706细胞周期和诱导细胞凋亡并上调食管癌EC9706细胞CAR的表达水平。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一章 食管癌EC9706柯萨奇-腺病毒受体表达水平的检测

1.材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学处理

2 实验结果

2.1 免疫细胞化学方法检测EC9706和Hela细胞表面CAR的表达

2.2 免疫荧光细胞化学方法检测EC9706和Hela细胞表面CAR的表达

2.3 Western-bloting检测肿瘤细胞表面CAR的表达

2.4 RT-PCR检测EC9706细胞CAR的表达

3 讨论

4 结论

第二章 TSA对食管癌EC9706细胞生物活性的影响

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学处理

2 实验结果

2.1 倒置显微镜下细胞形态观察

2.2 TSA对细胞生长抑制作用

2.3 TSA对EC9706细胞周期的作用

2.4 Western-blotting检测TSA处理EC9706细胞P21,P27的表达

2.5 TSA对EC9706细胞凋亡的作用

2.6 Western-blotting检测TSA处理EC9706细胞Bax、Bcl-2蛋白的表达

2.7 免疫细胞化学方法检测各组EC9706CAR的表达

2.8 免疫荧光细胞化学方法检测各组EC9706CAR的表达

2.9 流式细胞仪检测Hela、EC9706细胞表面CAR的表达

2.10 Western-blotting检测各组细胞CAR蛋白的表达

2.11 RT-PCR检测各组细胞CAR mRNA的表达

3 讨论

4 结论

参考文献

综述 柯萨奇腺病毒受体CAR的研究进展和意义

参考文献

附录中英文专业词对照表

个人简历

致谢