c-fos基因去甲基化在氟致L-02细胞凋亡中的作用

摘要

地方性氟中毒是一种严重危害人体健康的全身性疾病，除损害机体骨相组织以外，还可损害机体的非骨相组织。肝脏是人体主要的解毒器官，氟化物对其毒性尤其受到人们的广泛关注。动物实验结果显示，过量氟对肝脏具有毒性作用，可致其产生脂质过氧化损伤；氟中毒可致大鼠肝细胞变形、索排列紊乱、胞浆结构疏松、细胞核膜皱折、固缩、核仁边集等改变，这些结果都说明氟对肝细胞有直接损害作用。随着研究的深入，细胞凋亡在氟致肝脏毒性机制中的作用引起了人们的关注。体外实验发现，氟化物可降低机体抗氧化能力，引起肝细胞凋亡，而以往的研究结果显示氧化应激在一定程度上可以诱导细胞凋亡。
　　 原癌基因c-fos是受促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）旁路调控而控制细胞增殖的即时早刻基因（immediately early genes，IEGs），具有促凋亡作用，在细胞生长调节和胞内信号传递中具有极为重要的作用。许多致癌因子均可通过对MAPK 旁路中不同调控环节作用而诱导细胞c-fos基因异常表达，影响细胞的增殖和凋亡。业已证明，过量氟可导致成纤维细胞和成骨细胞凋亡，并伴有c-fos基因的表达。进一步研究发现，c-fos基因的异常甲基化可能是导致其表达失调的主要原因。在对肿瘤的大量研究中发现，c-fos基因的甲基化能够导致其表达下调，也因此抑制了肿瘤细胞的凋亡。在缺血再灌注损伤及对大鼠肝组织诱导损伤的研究中也得出相似结论。
　　 DNA 甲基化是哺乳动物中常见的一种结构修饰，也是外遗传体系中的一种重要机制。DNA 甲基化是以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）为甲基供体，在DNA 甲基转移酶（DNA methytransferse，Dnmts）催化下，将甲基加到CpG 二核苷酸胞嘧啶的第五位碳原子上，使之变成5-甲基胞嘧啶（5mC）的化学修饰过程。在DNA 甲基化过程中，Dnmts发挥了重要的作用。研究发现，Dnmts是外源化合物的作用靶点，外源化合物通过改变Dnmts的表达水平和活力，影响DNA 甲基化和表观遗传的调节功能。目前认为，在哺乳动物中具有功能的DNA 甲基转移酶可分2 类：(1)Dnmt1：持续性DNA 甲基转移酶，它能建立新的甲基化模式，即使DNA中未甲基化的碱基对CG的胞嘧啶甲基化，作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链，使其完全甲基化；(2)Dnmt3a、Dnmt3b：从头甲基转移酶，它们可甲基化CpG 岛，使其半甲基化，继而全甲基化。一般认为，甲基化水平与基因表达呈负相关，即DNA 甲基化程度越低，基因表达水平越高；反之，甲基化程度越高，基因表达水平越低。
　　 鉴于过量氟是否会引起c-fos基因去甲基化及过量氟的肝毒性作用是否与c-fos基因去甲基化有关目前尚未见报道，因此本研究拟通过培养人胚胎肝细胞（L-02）接触不同剂量氟化钠（sodium fluoride，NaF）后，观察氟对c-fos、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3bmRNA表达水平的影响以及氟诱导的细胞凋亡与c-fos基因去甲基化的关系，从而探讨c-fos基因去甲基化在氟致L-02细胞凋亡中的作用。
　　 本研究主要由以下三部分组成:
　　 第一部分、氟对L-02细胞凋亡、c-fos mRNA 及蛋白表达的影响
　　 目的：探讨NaF对L-02细胞凋亡、c-fos mRNA 及蛋白表达的影响。
　　 方法：体外培养的L-02细胞暴露于不同浓度NaF（0、20、40、80 μg/ml），24 h后检测细胞存活率、凋亡率、c-fos mRNA 及蛋白表达水平。
　　 结果：与对照组比较，40、80 μg/ml 染毒组细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；细胞凋亡率随染毒剂量的升高呈上升趋势，且40、80 μg/ml 染毒组细胞凋亡率均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；20、40、80 μg/ml 染毒组c-fos mRNA表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；40、80 μg/ml 染毒组c-Fos 蛋白表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：NaF可诱导L-02细胞凋亡，引起c-fos mRNA及蛋白表达水平的升高。
　　 第二部分、氟对L-02细胞Dnmtl、Dnmt3a和Dnmt3b mRNA表达的影响
　　 目的：探讨NaF对L-02细胞Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA表达的影响。
　　 方法：体外培养的L-02细胞暴露于不同浓度NaF（0、20、40、80 μg/ml），24 h后检测Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA表达水平的情况。
　　 结果：随着NaF 染毒剂量的增加，Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA表达水平均呈下降趋势，20、40、80 μg/ml 染毒组Dnmtl mRNA表达水平均明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；80 μg/ml染毒组Dnmt3a mRNA表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；40、80 μg/ml 染毒组Dnmt3b mRNA表达水平均明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：NaF可使L-02细胞Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b的mRNA表达水平降低。
　　 第三部分、亚硫酸氢钠修饰测序法检测NaF对L-02细胞c-fos基因甲基化的影响
　　 目的：用亚硫酸氢钠修饰后测序法检测氟染毒L-02细胞c-fos基因启动子区CpG岛甲基化状态。
　　 方法：亚硫酸氢钠修饰不同浓度NaF（0、20、40、80 μg/ml）染毒24 h的L-02细胞，针对c-fos基因启动子区DNA 序列设计特异性引物，用普通PCR扩增，PCR 产物纯化回收后测序比对。
　　 结果：NaF 染毒对照组L-02细胞c-fos基因启动子区扩增产物共检测出144个碱基，有10个CG 未转变，其余C 均转变为T；低、中、高剂量组各有1个CG 未转变，其余C 均转变为T。
　　 结论：L-02细胞经NaF 染毒后，c-fos基因甲基化水平下降，c-fos基因去甲基化活化可能是氟致L-02细胞凋亡过程中c-fos基因表达上调的一条途径。