拟Smac新型促凋亡多肽分子对凋亡下游蛋白质组的影响及诱导凋亡的研究

摘要

本研究分为六部分：
　　 实验一：拟Smac促凋亡多肽的合成及其生物活性的初步研究
　　 目的：探讨拟Smac 多肽的合成及其对膀胱癌细胞的促凋亡生物活性。
　　 方法：应用固相多肽合成技术，合成具有细胞膜穿透性SmacN7 融合多肽，经RP-HPLC 纯化、纯度分析，用质谱仪定性鉴定；通过荧光显微镜观察细胞凋亡形态、细胞增殖抑制率测定及流式细胞仪分析，研究其对低剂量丝裂霉素C诱导的膀胱癌T24细胞的凋亡促进作用。
　　 结果：可穿透性融合多肽SmacN7 产物峰纯度达95%以上，分子量为3278.08，质谱鉴定结果与合成预期结果完全一致；50 μg/L～500 μg/L SmacN7作用12h～48h，肿瘤细胞出现典型的凋亡形态学改变；随着SmacN7 浓度的增加或作用时间的延长,细胞增殖抑制率出现明显增加，药物作用12h、24h、48h后增殖抑制率分别为（9.62±1.07）%～（61.48±1.15）%、（24.17±1.02）%～（72.86±1.68）%、（43.24±1.15）%～（84.91±1.74）%；肿瘤细胞凋亡率也明显增加，分别为（6.12±1.16）%～（49.81±2.11）%、（13.47±1.15）%～（64.54±2.27）%、（28.91±1.08）%～（82.36±2.19）%。
　　 结论：固相合成的拟Smac 融合多肽SmacN7 为高纯度的目的肽，能够稳定地转入细胞内且利用率高，并有明显促进低剂量丝裂霉素C诱导的膀胱癌T24细胞凋亡的生物活性，为进一步研究膀胱肿瘤的生物治疗积累了有价值的资料。
　　 实验二：人工合成拟Smac 融合多肽促低剂量丝裂霉素C诱导膀胱癌细胞凋亡的研究
　　 目的：探讨人工合成拟Smac 融合多肽（SmacN7）对低剂量丝裂霉素C(MMC)诱导的膀胱癌T24细胞凋亡的促进作用。
　　 方法：运用固相多肽合成技术人工合成SmacN7细胞可穿透性融合多肽，0.05mg/ml MMC诱导的膀胱癌T24细胞与50 μg/L～500 μg/L的SmacN7 融合多肽共同孵育4h～48h后，采用Annexin－V荧光染色检测肿瘤细胞凋亡；流式细胞术和MTT 比色检测诱导后T24细胞凋亡率、增殖抑制率与SmacN7的时间和浓度效应关系。
　　 结果：50 μg/L～500 μg/L SmacN7作用4h～48h，肿瘤细胞出现典型的凋亡形态学改变，随着SmacN7 浓度的增加或药物作用时间的延长，肿瘤细胞凋亡率也增加，12h 为5.67%～56.12%，24h 为14.54%～65.24%，48h 为31.48%～87.23%，同时细胞增殖抑制率出现明显增加，药物作用12h、24h、48h后增殖抑制率分别为9.58%～63.42%、28.94%～72.3%、44.7%～87.12%。
　　 结论：SmacN7 能够有效地促进低剂量丝裂霉素C诱导的膀胱癌T24细胞凋亡，并具有时间和浓度依赖性，为膀胱肿瘤的生物治疗提供了新思路。
　　 实验三：人工合成拟Smac多肽增强膀胱癌细胞化疗敏感性的实验研究
　　 目的：探讨人工合成拟Smac细胞可穿透性促凋亡融合多肽SmacN7对膀胱癌化疗药物敏感性的促进作用。
　　 方法：人工合成细胞可穿透性促凋亡融合多肽SmacN7；噻唑蓝（MTT）检测SmacN7 融合多肽对低剂量丝裂霉素C(MMC)诱导的膀胱癌T24细胞的相对存活率；Annexin V/PI 双标流式细胞术检测T24细胞的凋亡；Western blot检测SmacN7融合多肽与MMC 联用后T24细胞内XIAP、Caspase-3 蛋白的表达；同时检测Caspase-3活性及SmacN7 融合多肽与MMC 联用对T24细胞的杀伤作用。
　　 结果：SmacN7 融合多肽能穿透细胞并与内源性XIAP结合，增加低剂量MMC诱导的T24细胞凋亡并呈时间和浓度依赖性；能显著降低细胞内XIAP的表达水平，增强Caspase-3的表达及活性；在24h和48h，SmacN7+MMC组与单用MMC组相比，T24细胞的存活率分别降低2.22 倍和3.61 倍。
　　 结论：人工合成拟Smac细胞可穿透性促凋亡融合多肽能够促进化疗药物诱导的膀胱癌T24细胞凋亡，抑制细胞增殖，增强膀胱癌细胞对MMC的化疗药物敏感性。
　　 实验四：拟Smac合成肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物的制备及性能研究
　　 目的：探讨拟Smac合成肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物的制备及联合恒定外磁场体外对膀胱癌细胞的凋亡促进作用。
　　 方法：以羧甲基壳聚糖为骨架与具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒合成纳米载体粒子，将拟Smac 合成肽SmacN7与其结合，制备拟Smac 合成肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物，并通过透射电镜、振动样磁强计等考察其理化性质；Hoechst33258 染色观察外加磁场下纳米复合物诱导膀胱癌T24细胞凋亡的形态，MTT比色分析法观察其对肿瘤细胞的生长抑制作用。
　　 结果：拟Smac 合成肽羧甲基壳聚糖磁性纳米粒子的粒径约为46.2nm；磁化曲线提示具有超顺磁性；载药量和包封率分别为（31.8±3.6）％和（65.2±2.4）％并具有良好的药物控释性能；外加磁场下磁性纳米粒子能使肿瘤细胞呈现明显的凋亡形态改变并表现出显著的生长抑制活性。
　　 结论：拟Smac 合成肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物具有粒径小、较强的磁响应性、超顺磁性、载药量和包封率高和良好的药物缓释性能，联合恒定外磁场具有明显的促进肿瘤细胞凋亡的作用，为膀胱肿瘤的生物治疗提供了新的切入点。
　　 实验五：拟Smac 合成肽磁性纳米颗粒诱导膀胱癌细胞凋亡的体外实验研究
　　 目的：研究拟Smac 合成肽磁性纳米颗粒的制备及其协同恒定外磁场体外对人膀胱癌T24细胞的生长抑制作用并探讨其作用机制。
　　 方法：氧化还原法制备SmacN7-O-CMC-MNPS 并检测其理化性质，倒置显微镜和电镜观察细胞形态，TUNEL法检测细胞凋亡，MTT、流式细胞术分别观察SmacN7-O-CMC-MNPS 联合化疗药物及恒定外磁场体外对人膀胱癌T24细胞的生长抑制作用，SABC法观察Bcl-2/Bax 蛋白的表达，Western blot检测XIAP 蛋白的表达。
　　 结果：SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒直径46.2nm，呈球形，载药量(31.8±3.6）%，磁响应性良好。含相同浓度SmacN7的单纯SmacN7-O-CMC-MNPS对膀胱肿瘤T24细胞的生长抑制率和凋亡率无明显影响，但协同外磁场及在化疗药物的诱导下其对肿瘤细胞的生长抑制作用明显增强；Bcl-2 蛋白表达水平下调同时Bax 蛋白的表达增强，外磁场组与化疗药物组差异有统计学意义（P<0.05），协同外磁场时Western blot检测不同时间XIAP 蛋白的表达显著降低。
　　 结论：SmacN7-O-CMC-MNPS的制备不影响SmacN7的生物活性；恒定外磁场下其对肿瘤细胞的促凋亡作用明显增强，为膀胱肿瘤的生物靶向治疗奠定了实验基础。
　　 实验六：拟Smac合成肽磁性纳米颗粒在膀胱癌裸鼠移植瘤靶向治疗的体内实验和机制研究
　　 目的：研究拟Smac合成肽磁性纳米颗粒对膀胱癌裸鼠移植瘤的体内靶向治疗作用并探讨其机制。
　　 方法：40只荷瘤裸鼠随机分成5组，每组8只，按不同组别(A、B、C、D、E组)给于不同治疗，各组每天治疗1 次，连续1wk，磁场组在肿瘤部位施加0.8T外磁场30min。观察裸鼠的进食、活动及生长情况、测瘤体积并计算抑瘤率；治疗后32d处死动物，HE染色和电镜观察细胞结构，采用SABC法观察Bcl-2/Bax 蛋白的表达，采用RT—PCR法检测各组肿瘤组织XIAPmRNA和Caspase-3mRNA的表达，Western blot法检测各组肿瘤组织XIAP和Caspase-3 蛋白表达。
　　 结果：治疗期间及治疗后各组裸鼠的进食、活动及生长情况未见明显异常，体重差异无统计学意义（p＞0.05），SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒加MMC 联合外加磁场组（E组）移植瘤体积增长最为缓慢且对膀胱癌移植瘤有明显抑制作用，抑瘤率为58.4%，高于SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒加MMC组（C组）(24.6%)和SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒加外加磁场组（D组）(32.2%)；免疫组化SABC法检测E组Bcl-2蛋白表达水平下调同时Bax 蛋白的表达增强，与C、D组比较差异有统计学意义（p<0.05）；RT—PCR结果示E组能显著下调XIAPmRNA的表达，同时上调Caspase-3mRNA的表达；Western blot 显示E组能下调XIAP 蛋白的表达同时上调Caspase-3 蛋白的表达。
　　 结论：在外加磁场和小剂量丝裂霉素C的共同作用下，SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒在体内具有明显的体内促进肿瘤凋亡、抑制肿瘤生长的作用，通过下调XIAP、上调Caspase-3 在mRNA和蛋白方面的表达达到肿瘤靶向治疗效果，为膀胱肿瘤的治疗探索出一条新的途径。