RNA干扰AKT2对胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的影响及相关机制研究

摘要

胰腺癌是一种临床表现隐匿、发展迅速、预后很差的消化系统恶性肿瘤，该疾病早期诊断十分困难，治疗方法相当有限，总体死亡率很高。在西方发达国家，胰腺癌的总体死亡率已由第5位升至第4位。而在中国，胰腺癌是消化系统恶性肿瘤的三大死亡原因之一，85%的患者在初次就诊时已属晚期，根治性胰腺癌手术切除率仅为10%～15%，5年总体生存率不到5%。目前化学治疗仍是胰腺癌综合治疗的重要手段之一。吉西他滨属于新一代阿糖胞苷类似物，临床应用发现可以有效改善晚期胰腺癌患者的疾病相关症状和并提高患者生活质量，于1996年被美国食品与药品监督管理局(FDA)批准正式取代5-氟尿嘧啶成为抗胰腺癌一线药物，并被广泛视作临床研究的―金标准。1997年一项关于吉西他滨的Ⅲ期临床试验显示，吉西他滨可显著改善患者症状、延长患者中位生存期并使患者受益。但是恶性肿瘤化疗的耐药性是影响化疗效果、疾病预后的最大问题。如何提高吉西他滨为主的胰腺癌化疗敏感性成为当前临床研究和实验研究的热点问题。
　　 近年以来，已经有多项实验研究显示PI3K/Akt信号转导通路系统与恶性肿瘤化疗耐药关系十分密切。多药耐药基因(mdr-1)家族是研究最早的目前公认的恶性肿瘤多药耐药相关基因。多药耐药基因的过度表达导致恶性肿瘤细胞生存力增强，抗化疗药物及抗凋亡能力增强，从而降低多种肿瘤化疗药物的细胞毒性作用。而这个过程受很多因素影响，其中PI3K/Akt信号转导通路系统在其中发挥了十分重要的作用。已有多项研究表明PI3K/Akt信号转导通路网络系统通过上调(multidrugresistance-related protein 1，MRP1)MRP1的表达而导致恶性肿瘤细胞产生化疗耐药现象，MRP1基因表达水平与PI3K/Akt信号通路表达水平在急性髓性白血病细胞中呈正相关性关系。另有研究利用传统的PI3K 抑制剂渥曼青霉素来抑制Akt基因的磷酸化活化之后，MRP1基因的表达水平也随之下降。Abdul-Ghani等的实验研究也表明PI3K/Akt信号通路可以显著上调MRP1基因的表达水平，从而降低恶性细胞的凋亡，而另一种PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002 能够使恶性肿瘤细胞凋亡率大幅度提高。
　　 以上这些结果均提示我们沉默AKT基因表达可能成为临床上增加胰腺癌化疗敏感性的一种可行性的方法。
　　 按照以上实验设想并在我的导师王春友教授的指导和支持下，我在我院普外科实验室开展了RNA干扰AKT2对胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的影响及相关机制研究。为此，我们通过(1)RNA干扰胰腺癌细胞AKT2的表达对吉西他滨敏感性的体外实验，(2)RNA干扰AKT2对胰腺癌裸鼠移植瘤的吉西他滨敏感性的体内实验，这两部分来观察RNA干扰AKT2对胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的影响。然后通过(3)建立胰腺癌吉西他滨耐药细胞系，(4)RNA干扰AKT2表达逆转胰腺癌细胞耐药的实验研究，这两部分来初步探讨RNA干扰AKT2对改变胰腺癌耐药性的相关机制。通过以上实验为进一步阐明胰腺癌化疗耐药的分子生物学机理，从而在分子水平上寻找其中的关键基因并开发相应靶向治疗，达到提高胰腺癌化疗疗效提供理论基础。
　　 第一部分：PANC-1细胞中AKT2的表达对吉西他滨敏感性的实验研究
　　 目的：
　　 研究胰腺癌细胞Panc-1中AKT2的表达对吉西他滨敏感性的影响。
　　 方法：
　　 在体外条件下将AKT2特异性siRNA表达载体pAKT2-siRNA转染至胰腺癌细胞株Panc-1，应用RT-PCR、Western blot方法检测转染siRNA后Panc-1细胞中AKT2基因mRNA和蛋白的表达变化，应用MTT法检测RNA干扰AKT2后Panc-1细胞对吉西他滨敏感性的变化情况。
　　 结果：
　　 转染AKT2 siRNA后Panc-1细胞AKT2基因mRNA和蛋白的表达水平显著下降；吉西他滨对Panc-1细胞的半数细胞抑制量从1.96±0.22μg/ml降到0.24±0.03μg/ml，Panc-1细胞对吉西他滨的敏感性显著增加。
　　 结论：
　　 AKT2 siRNA 能够抑制AKT2表达，并能增加胰腺癌细胞株Panc-1对吉西他滨的敏感性。
　　 第二部分：RNA干扰AKT2对人胰腺癌裸鼠移植瘤的吉西他滨敏感性的实验研究
　　 目的：
　　 研究RNA干扰AKT2对人胰腺癌裸鼠移植瘤的吉西他滨敏感性的影响。
　　 方法：
　　 首先构建荷胰腺癌的裸鼠模型，采用腹腔给药和瘤内注射方式，以吉西他滨配合AKT2 siRNA表达载体对瘤鼠进行联合干预治疗以对比观测各组裸鼠肿瘤生长情况，RT-PCR检测各组肿瘤细胞的AKT2 mRNA表达情况，免疫组织化学法检测各组肿瘤AKT2 蛋白表达，DNA 末端原位标记法(TUNEL法)检测各组肿瘤组织细胞的凋亡指数。
　　 结果：
　　 化疗+AKT2-siRNA组移植瘤组织中AKT2 mRNA 及AKT2 蛋白表达显著低于空白对照组、化疗组以及化疗+阴性质粒组。化疗+AKT2-siRNA组肿瘤重量、肿瘤体积显著低于其他各对照组。化疗+AKT2-siRNA组抑瘤率、凋亡指数显著高于其他各对照组。
　　 结论：
　　 RNA干扰AKT2 能够显著提高胰腺癌吉西他滨化疗的敏感性。
　　 第三部分：胰腺癌吉西他滨化疗耐药细胞系的建立及其特性鉴定
　　 目的：
　　 建立胰腺癌吉西他滨化疗耐药细胞系，并对该细胞系的生物学特性进行研究。
　　 方法：
　　 通过逐步递增细胞培养基中吉西他滨的浓度，建立对吉西他滨化疗耐药的胰腺癌细胞系Panc1-Gem。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验两种方法，计算出Panc1和Panc1-Gem 两种细胞系的半数细胞抑制浓度(IC50)及耐药系数(RI)：对比观察Panc1和Panc1-Gem 两细胞系的生长曲线，并计算出Panc1和Panc1-Gem 两细胞系的倍增时间。
　　 结果：
　　 吉西他滨对Panc1的IC50为1.96±0.22μg/ml和吉西他滨对Panc1-Gem的IC50为239.82±35.47 μg/ml，MTT所测的RI 值为122.36(P<0.05)。集落形成实验的所得RI为118.93。根据生长曲线计算出Panc1的倍增时间为27.1h，Panc1-Gem的倍增时间为35.2h。
　　 结论：
　　 已成功构建了对吉西他滨化疗耐药的胰腺癌细胞系Panc1-Gem，耐药性能十分明显而稳定,该细胞系适合用于胰腺癌吉西他滨化疗耐药的研究。
　　 第四部分：AKT2 在胰腺癌细胞吉西他滨化疗耐药中的作用
　　 目的：
　　 研究AKT2、多药耐药基因(mdr-1）以及脱氧胞苷激酶(dCK)，在人胰腺癌细胞系Panc-1 吉西他滨(GEM)化疗耐药中的相互关系及调控作用。
　　 方法：
　　 通过逐步增加药物浓度的方法，诱导建立了耐吉西他滨的胰腺癌细胞系。应用RNA干扰耐吉西他滨的胰腺癌细胞系AKT2表达来进行逆转化疗耐药实验，并采用了Western Blot、RT-PCR 以及MTT法，来评价AKT2与mdr-1、dCK 两个基因表达情况的相互调控关系及评估逆转化疗耐药的效果。
　　 结果：
　　 Western Blot、RT-PCR结果显示，耐药细胞Panc1-GEM的mdr-1 在蛋白表达、mRNA转录水平上比其亲本细胞系Panc1增强，而脱氧胞苷激酶(dCK)基因在蛋白表达、mRNA转录水平上比其亲本细胞系Panc1 减弱。经过RNA干扰耐GEM的胰腺癌细胞株AKT2表达作用后，mdr-1 在蛋白表达、mRNA转录水平上减弱，而脱氧胞苷激酶(dCK)基因在蛋白表达、mRNA转录水平上增强。耐药细胞Panc1-GEM对吉西他滨的IC50为239.82±35.47 μg/ml，耐药系数（RI）为121.94；经过RNA干扰耐GEM的胰腺癌细胞株AKT2表达作用后对吉西他滨的IC50为113.45±21.89 μg/ml，RI为57.88。
　　 结论：
　　 胰腺癌细胞对吉西他滨耐药的原因与dCK 减少有关，同时也与mdr-1 升高相关。
　　 AKT2可能参与调控mdr-1、dCK基因表达，从而介导胰腺癌细胞株Panc-1 吉西他滨化疗抵抗。