hBcl-2基因修饰骨髓基质细胞对体外培养PC12细胞保护作用的研究

摘要

本研究分为二部分：
　　 第一部分：H2O2对PC12细胞活性影响的实验研究
　　 由于脑组织几乎没有供能物质储备，全部依靠血液循环带来的氧、葡萄糖来维持和执行正常的生理功能。脑组织对缺氧异常敏感，并且容易产生氧化应激损伤，其中氧自由基在氧化应激损伤中起到了重要的作用。H2O2在实验中常用来模拟氧自由基的作用，而PC12细胞在实验研究中可以作为神经元的替代细胞。PC12是来源于嗜铬细胞瘤的细胞株易培养可传代，作为神经元的替代细胞是一个比较理想的细胞模型。
　　 目的：研究H2O2对PC12细胞活性的影响。
　　 方法：培养PC12细胞，当细胞贴壁约70％时用手拍打培养瓶让细胞到培养液中，用移液器把细胞吹散。转移适量的细胞到新的培养器皿中传代，摇晃均匀制成细胞悬液，将PC12细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100μL，调节PC12的密度为2×105ml。置培养箱中培养24小时，依次分为5组，加入PC12细胞培养基后，分别加入不同剂量的H2O2 使其终浓度分别为(0、50、100、150、250、300nmol/L)继续培养8小时。8小时后更换培养基，继续培养24小时后用MTT法检测细胞活力。另一方面我们用250nmol/L的H2O2分别处理PC12细胞0、2、4、6、8、10小时后更换培养基。继续培养24小时后用MTT法检测细胞活力。
　　 结果：不同浓度的H2O2对PC12细胞的活性有不同的影响，当用50nmol/L的H2O2处理PC12细胞8小时，其活性轻度增加(P<0.05)；当处理时间不变H2O2浓度的进一步提高时(浓度波动于100-300nmol/L 范围时)，PC12细胞活性则受到明显的抑制,当H2O2 达到300nmol/L时,大多数PC12细胞死亡(P<0.01)。
　　 当用250nmol/L的H2O2 作用于培养的PC12细胞不同的时间段，PC12细胞活力随时间依赖性下降，从处理6小时起始有统计意义(P<0.05)，PC12细胞活力较对照组相比有所下降。250nmol/L的H2O2 作用于培养的PC12细胞8小时,导致PC12细胞活性约为对照组的50％(P<0.05)，处理10小时PC12细胞活性明显下降(P<0.01)。
　　 结论：不同浓度的H2O2对PC12细胞的活性有不同的影响，低浓度的H2O2处理8小时对PC12细胞活力有一定的促进作用，而中高浓度的H2O2 作用8小时PC12细胞的活力下降，H2O2 浓度越高及处理时间越长，PC12细胞的活力下降越明显。
　　 第二部分：hBcl-2基因修饰骨髓基质细胞对体外培养PC12细胞保护作用的研究
　　 近年来，利用神经干细胞进行脑卒中治疗是实验研究中的热点，而在神经干细胞的研究中，骨髓基质细胞由于来源广泛没有社会伦理的限制得到了广泛的应用。本试验利用基因hBcl-2转染骨髓基质细胞构建了MSCs-hBcl-2基因工程细胞，并观察其对体外培养的氧化损伤的PC12细胞的保护作用。
　　 目的：观察hBc l-2基因修饰的骨髓基质细胞对体外培养PC12细胞的作用。
　　 方法：采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠骨髓基质细胞、并利用其独特的免疫学标志作鉴定。利用脂质体转染的方法将pcDNA3-hBcl-2转染MSCs 构建MSCs-hBcl-2基因工程细胞。转染后用G418 进行阳性细胞筛选，并搜集MSCs-hBcl-2基因工程细胞培养上清。将PC12细胞接种于96孔板中并分为4组(①MSCs-hBcl-2组、②MSCs组、③MSCs 空质粒组、④空白对照组)，分别加入MSCs-hBcl-2 培养上清液、MSCs 培养上清液、MSCs 空质粒培养上清液和PC12 培养基。使培养上清液的体积百分比为10％。然后使在H2O2 终浓度250nmol/L 作用下继续培养8小时。用MTT法检测吸光度(A)值及TUNEL检测细胞调亡的方法来观察MSCs-hBcl-2基因工程细胞的培养上清对PC12细胞的影响。
　　 结果：成功的培养出MSCs，对传代的骨髓基质细胞进行免疫组化CD44、CD71染色结果显示所有细胞的胞浆或胞膜有棕黄色颗粒，提示其CD44、CD71表面标志表达阳性。将hBcl-2基因成功的转染了MSCs 构建了MSCs-hBcl-2基因工程细胞，用G418 筛选后发现转染后的细胞均有hBcl-2 蛋白的表达。氧化损伤的PC12细胞中加入各组细胞培养上清液后对其有一定的保护作用，不同的细胞培养上清液对PC12细胞的保护作用不同，MSCs-hBcl-2组保护作用最强(P<0.01)。
　　 MSCs组有一定的保护作用(P<0.05)，MSCs-hBcl-2组较MSCs组具有更强的保护作用(P<0.05)。MSCs-hBcl-2组较MSCs组的TUNEL 阳性细胞数明显减少(P<0.01)。MSCs组与对照组相比TUNEL 阳性细胞数减低(P<0.05)。MSCshBcl-2组与对照组相比TUNEL 阳性细胞数明显减低(P<0.01)。
　　 结论：MSCs-hBcl-2基因工程细胞的培养上清对PC12细胞的保护及抗调亡作用比骨髓基质细胞的培养上清更强。