血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13及其突变体的功能研究

摘要

第一部分ADAMTS13及其突变体重组蛋白的纯化和鉴定
　　 目的：为了研究ADAMTS13及其突变体的功能，纯化并鉴定高纯度和生物学活性的ADAMTS13及其突变体的重组蛋白，为后续实验打下重要基础。
　　 方法：设计针对ADAMTS13及其突变体基因序列的特异性引物，PCR方法获得目的DNA基因片段，并克隆至pcDNA3.1-V5-His TOPO载体上。将成功构建的ADAMTS13及其突变体质粒转染HEK293细胞，western blot检测各细胞的蛋白表达情况。通过G418筛选获得稳定表达细胞，收集稳定细胞所表达ADAMTS13及其突变体重组蛋白的培养上清，依次通过Q-fast flow离子结合柱，Ni-NTA亲和层析柱以及分子筛以获得各种纯化的重组蛋白，采用考马斯亮蓝染色检测其纯度和分子量大小。
　　 结果：成功构建ADAMTS13及其突变体的表达载体，并在真核细胞内稳定表达。经过纯化的各种重组蛋白纯度很高且分子量大小正确。
　　 结论：体外成功表达并纯化ADAMTS13及其突变体的重组蛋白，为后续的实验打下重要基础。
　　 第二部分ADAMTS13及其突变体功能的体外实验研究
　　 目的：研究体外剪切力条件下，比较同等特异性活性的ADAMTS13及其突变体delCUB、MDTCS裂解vWF的时间依赖性，酶浓度依赖性和底物浓度依赖性的差异。
　　 方法：应用FRETS-VWF73作为底物，检测ADAMTS13及其突变体的特异性活性。并在剪切力2500rpm（即2.5dyn/cm2）时，分别于不同时间（0，10，20，30和60min），不同酶浓度（特异性活性0,12.5, 25，50，100， 200和300mU/ml）或不同底物VWF多聚体浓度（0,18.75, 37.5, 75, 150, 300nM）条件下，运用1％ agarose凝胶电泳研究ADAMTS13及其突变体裂解VWF多聚体能力的差异。
　　 结果：在ADAMTS13及其突变体特异性活性相同时，ADAMTS13及其突变体裂解VWF多聚体能力均随剪切力作用时间延长，酶浓度增加和底物浓度增加呈现最初快速增加之后缓慢增加的趋势，且ADAMTS13及其突变体各组之间对VWF多聚体的裂解能力均无统计学意义（p>0.05）。
　　 结论：ADAMTS13及其突变体在体外剪切力条件下，裂解VWF多聚体具有相似能力。
　　
　　 第三部分 ADAMTS13及其突变体功能的体内实验研究
　　 目的：研究ADAMTS13及其突变体的重组蛋白在动物体内血栓形成过程中功能的差异。
　　 方法：1.ADAMTS13的FL或MDTCS重组蛋白注射入ADAMTS13基因敲除（ADAMTS13-/-）小鼠体内，应用10％的FeCl3损伤右侧颈动脉，Doppler探头检测血管损伤处血栓完全形成的时间。注射PBS和缺失C结构域六个氨基酸的重组蛋白（del6aa）作为对照组。将TSP5-8CUB重组蛋白注射入野生型C57BL/6小鼠体内，同样应用10％的FeCl3损伤右侧颈动脉，Doppler探头检测血管损伤处血栓完全形成的时间。比较各种蛋白在FeCl3损伤颈动脉血栓形成动物模型中完全形成栓塞时间的差异。
　　 2.ADAMTS13的FL或MDTCS重组蛋白与荧光（calcein AM）标记的血小板分别注射入ADAMTS13-/-小鼠体内，应用10％的FeCl3损伤肠系膜动脉5min，在体荧光显微镜和摄像装置记录实时血栓形成和完全栓塞的时间，比较各种蛋白在FeCl3损伤肠系膜动脉血栓形成动物模型中完全形成栓塞时间的差异。
　　 结果：1.注射PBS, FL, MDTCS或del6aa的ADAMTS13-/-小鼠完全形成栓塞的时间分别为5.3±0.4min，12.7±1.7min，22.0±2.1min，5.9±1.9min，WT小鼠完全形成栓塞的时间为10.0±1.3min， 注射TSP5-8CUB的WT小鼠完全形成栓塞的时间为5.5±2.1min。PBS组与WT组之间，FL组与PBS组之间，MDTCS组与PBS组之间均有统计学意义（p<0.01）, 并且FL组与MDTCS组之间也有统计学意义（p<0.01）。El6aa组与PBS组之间，TSP5-8CUB组与WT组之间均无统计学意义（p>0.05）。
　　 2.FeCl3诱导肠系膜动脉损伤形成血栓时间，WT小鼠为12.5±1.2 min，注射PBS的ADAMTS13-/-小鼠为8.5±0.6 min，两组之间有统计学意义（p<0.01）；FL组为17.1±1.9min，MDTCS组为17.2±1.8 min，FL和MDTCS两组分别与PBS组比较，有统计学意义（p<0.01）。
　　 结论：MDTCS足以裂解新释放的vWF，并且对于FeCl3诱导的动脉性血栓具有保护性作用；其中，S结构域在ADAMTS13体内酶学功能十分重要；TSP5-8CUB具有体内抗血栓形成功能。

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文摘

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前 言

第一部分 ADAMTS13及其突变体重组蛋白的纯化和鉴定

第二部分 ADAMTS13及其突变体功能的体外实验研究

第三部分 ADAMTS13及其突变体功能的体内实验研究

小 结

血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13的研究进展

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