运用转染hTGF-β3基因的前软骨干细胞与自组装纳米肽支架KLD-12治疗软骨缺损的研究

摘要

目的：
　　 寻求一系列有效的干预手段促进种子工程学种子细胞前软骨干细胞体外增殖，并诱导其向成熟软骨细胞分化。研究已证实了的在干细胞向软骨细胞分化中起到关键作用的转化生长因子三类亚型：TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3对于目的前软骨干细胞增殖分化活动的不同效应，从而选择一种理想的细胞因子从而进一步将携带此细胞因的基因转染入种子细胞内实现自分泌效应细胞因子促进其增殖分化的目的。研究低频电磁场对于前软骨干细胞增殖分化的效应，试图寻找一种经济有效的干预手段。通过比较纳米转染材料对于三维和二维培养环境中前软骨干细胞转染效率的差异，寻找一种高效、安全的转染方法。最后将我们所得到的转基因的前软骨干细胞种植于KLD-12自组装肽纳米支架内，检测其体外增殖分化能力并移植至大鼠软骨缺损部位，用以观察我们所构建的组织工程学软骨的治疗效果。为利用组织工程学原理治疗软骨缺损寻找一种新的途径。
　　 方法：
　　 （1）通过免疫磁珠分选法得到经过筛选和纯化的PSCs细胞，使用含有浓度为10ng/ml的三种亚型的重组TGF-β培养基对PSCs进行培养。采用MTT法与BrdU/PI 双参法测不同组别PSCs培养后第0,3,6,9d细胞增殖及DNA合成水平，并采用rt-pcr法测定培养后第0，3，6，9天不同组别Col II,Aggrecan基因的表达情况。采用免疫组化法测定培养2周后各组细胞SOX9蛋白表达情况。
　　 （2）使用频率为50MzH，场强为1mT的脉冲电磁场（PEMF）对PSCs细胞进行干预，0.5h/次，2次/d，干预2，4，6d后收集细胞，以不给予磁场刺激的为空白对照。通过RT-PCR法检测细胞Ⅱ型胶原（Collagen-Ⅱ）和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的基因表达水平，再通过Western-blot法测定各组细胞ihh蛋白（印度豪猪蛋白）、PTHrp（甲状旁腺激素相关肽）蛋白的表达水平。
　　 （3）将PSCs细胞种植于KLD-12肽纳米纤维支架内，使用xfecttm stem纳米干细胞转染试剂将h TGF-β3基因分别转染入KLD-12三维支架内培养的PSCs和普通二维培养基培养的PSCs细胞，通过免疫荧光和RT-PCR法测定转染后48小时不同组别TGF-β3基因的表达情况，并利用ELISA法测定转染后不同时间细胞培养上清液中的TGF-β3浓度。将转染hTGF-β3基因的前软骨干细胞实验组细胞与未转染h TGF-β3基因的前软骨干细胞对照组细胞分别种植于KLD-12自组装纳米凝胶内，促其自组装形成包埋前细胞的纳米凝胶。免疫组化检测体外培养一周后两组细胞外基质成分coII的合成情况。采用western-blot法测定培养1周，2周，3周后两组细胞Aggrecan及SOX9蛋白表达情况。利用MTS法和BrdU/PI 双参法测定培养3、5天两组细胞的增殖活性。并将实验组A、B两组分别为包埋转染hTGF-β3基因细胞与未转基因前软骨干细胞的纳米凝胶移植入大鼠股骨软骨缺损处，对照组只使用无细胞成分的纳米凝胶，6周后观察各组软骨修复情况。
　　 结果：
　　 （1）培养三天后与对照组相比使用TGF-β1干预组的活性明显下降（P<0.05）,而TGF-β2、3组增殖活性与对照组相比较无明改变（P>0.05）。6天后，与对照组相比较TGF-β1组细胞增值活性明显降低(（P<0.01），而TGF-β2、3组则显示了相反的结果，使用TGF-β2、3组细胞的增殖活性较对照组明显增前且TGF-β3组高于TGF-β2组（P<0.05）。Rt-pcr分析显示随着时间的延长，与空白对照组相比实验组A、B、C Col II基因表达均呈上升趋势，然而使用TGF-β1与TGF-β3组Aggrecan的表达随时间延长而增加，但使用TGF-β2组Aggrecan的基因表达无明显改变。免疫组化显示与对照组相比，TGF-β1、TGF-β3组的SOX9蛋白合成高于对照组（P<0.05），而TGF-β2组与对照组相比无明显差异性（P>0.05）。
　　 （2）RT-PCR结果显示Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达随磁场刺激时间延长而增高，且经磁场刺激前软骨干细胞的聚集蛋白聚糖明显高于空白对照组（P<0.05，P<0.01）。Western-blot结果显示，ihh蛋白及PTHrp蛋白表达均随磁场刺激时间的延长增加，不同时间磁场刺激组ihh蛋白表达高于空白对照组 (P<0.01)；PTHrP的表达量也随之上升，但当磁场刺激4，6d后的PTHrP蛋白表达与空白对照组差异有显著性意义(P<0.05，P<0.01)。强度为1mT，频率为50MzH的PEMF能促进PSCs细胞向成熟软骨细胞增殖分化，其作用机制可能与改变ihh-PTHrp信号通路活性有关。
　　 （3）免疫荧光结果显示KLD-12三维支架内培养的PSCs转染后TGF-β3阳性细胞率较普通二维培养基内PSCs细胞明显增加的，与RT-PCR法检测结果相同差异具有统计学意义（P<0.05），ELISA法测定细胞培养上清液中的TGF-β3浓度显示转染后24h后PSCs细胞上清液TGF-β3蛋白水平呈上升趋势，72h后达到峰值，随后稍下降进入平台期。
　　 （4）在自组装纳米凝胶内培养的两组细胞均发现coII在细胞胞浆及周围沉积，且实验组coII染色阳性细胞率较对照组为多（P<0.05）。Western-blot显示随时间的延长，两组细胞的coII、Aggrecan及SOX9表达均呈上升趋势，且实验组三种蛋白的表达均高于对照组（P<0.05）。MTS法及BrdU/PI 双参法检测在培养后的3、5天是实验组的分裂增势活性高于对照组（P<0.05）。动物试验显示使用使用转基因种子细胞的实验组A修复软骨的效果优于实验组B，而对照组软骨缺损未观察到修复迹象。
　　 结论：
　　 TGF-β3对于前软骨干细胞的增殖促进作用以及诱导其向成熟软骨细胞分化分泌软骨细胞外基质的作用明显优于TGF-β1与TGF-β2，可选择作为组织工程干预因子。低频电磁场也具有诱导前软骨干细胞成熟分化的作用，可以作为辅助的物理干预手段。实验证明在KLD-12自组装肽纳米支架三维体系内前软骨干细胞的转染效率提高，且转染后的PSCs细胞增殖分化为表现成熟软骨表型能力均增强，并具有修复大鼠软骨缺损的治疗作用。综上，利用转染TGF-β3基因的前软骨干细胞与KLD-12自组装肽纳米支架构建的组织工程学软骨用以修复软骨缺损是一种极希望的治疗软骨损伤的途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉对照

声明

前 言

实验一：不同亚型转化生长因子β(TGF-β1、 TGF-β2、TGF-β3)对于前软骨干细胞增殖分化增值活动的影响

实验二：脉冲磁场对前软骨干细胞ihh-pthrp信号通路的影响

实验三：h TGF-β3 基因转染KLD-12自组装肽纳米纤维支架内三维培养的前软骨干细胞的研究

实验四：运用转染TGF-beta3基因的PSCs细胞与自组装纳米支架共同构建组织工程软骨组织研究

综述 基因治疗在治疗软骨缺损中的运用

全文总结

致 谢