hsa-miR-27a和hsa-miR-451在恶性肿瘤耐药细胞中的表达及与耐药关系的研究

摘要

第一部分 has-miR-27a和has-miR-451在P-glycoprotein高表达的恶性肿瘤耐药细胞中的表达
　　 目的：研究卵巢癌细胞及乳腺癌细胞中has-miR-27a和has-miR-451的表达差异。
　　 方法：用浓度递增法建立卵巢癌耐紫杉醇细胞系A2780/Taxol；Western blot 检测卵巢癌和乳腺癌细胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的表达；Stem-loop real-time PCR检测卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol和亲本细胞A2780以及乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/ADM和亲本细胞MCF-7中has-miR-27a和has-miR-451的表达。
　　 结果：成功建立了卵巢癌耐紫杉醇细胞株A2780/Taxol；P-gp在卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol和乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/ADM中明显高表达，在卵巢癌和乳腺癌亲本细胞A2780和MCF-7中均未检测到P-gp蛋白的表达；miR-27a在A2780/Taxol细胞中高表达，与A2780细胞相比，表达增高2.2±0.30倍,差异有统计学意义（p＜0.05）。在A2780和A2780/Taxol细胞中未检测出miR-451表达的差异。miR-451在MCF-7/ADM细胞中低表达，与MCF-7细胞相比，表达降低16±0.21倍,差异有统计学意义（p＜0.05）。在MCF-7和MCF-7/ADM中未检测出miR-27a表达的差异。
　　 结论：在P-gp高表达的卵巢癌耐紫杉醇细胞和乳腺癌耐阿霉素细胞中，miR-27a和miR-451分别特异性的表达异常。
　　 第二部分:has-miR-27a与卵巢癌耐紫杉醇细胞耐药关系的研究
　　 目的：研究has-miR-27a与卵巢癌耐紫杉醇细胞耐药的关系。
　　 方法：利用脂质体Lipofectamine 2000将成熟miR-27a的模拟物mimics、阻遏物inhibitors及阴性对照negative control RNA (NC) 转染A2780和A2780/Taxol细胞；Real-time PCR技术检测细胞多药耐药-1（MDR1）基因表达；蛋白印迹法检测转染后A2780/Taxol细胞P-gp和同源结构域相关的蛋白激酶2（homeodomain-interacting protein kinase 2, HIPK2）蛋白表达；MTT检测细胞增殖；Annexin-V FITC/PI双标法流式细胞术检测细胞凋亡率；流式细胞术检测细胞内罗丹明123（Rh-123）蓄积量。
　　 结果：1.A2780/Taxol细胞转染miR-27a inhibitors后（1）MDR1mRNA表达明显下降，与转染NC组相比，表达下降（39±0.14）％，差异有统计学意义（P<0.05）；（2）P-gp蛋白相对表达量（（26±5.3）％）与转染NC组的P-gp蛋白相对表达量（（43±6.7）％）比较，下降39％，差异有统计学意义（P<0.05）；（3）HIPK2蛋白相对表达量（（30±5.9）％）与转染NC组的HIPK2蛋白相对表达量（（19±3.8）％）比较，增高59％，差异有统计学意义（P<0.05）；（4）对紫杉醇的敏感性增加，半数抑制浓度（IC50）为0.53μM，与转染NC组IC506.8μM相比，差异有统计学意义（P<0.05）；（5）细胞凋亡率明显升高，凋亡率达（32.5士3.6）％，与转染NC组凋亡率（5.6士2.1）％比较，差异有统计学意义（P<0.05）；（6）细胞内Rh-123荧光强度增高为5.10士0.35，与转染前A2780/Taxol细胞的2.95士0.39和转染NC的A2780/Taxol细胞的3.30士0.45相比，均有显著性差异（P<0.05）。2. 转染miR-27a mimics后，（1）A2780细胞的MDR1mRNA表达升高，与转染NC组相比，升高(121±0.11)％，差异有统计学意义（P<0.05）；（2）A2780细胞对紫杉醇的敏感性下降，IC50为0.2μM，与转染NC组IC500.06μM相比，差异有统计学意义（P<0.05）；（3）A2780/Taxol细胞的HIPK2蛋白相对表达量（（8.1±4.9）％）与转染NC组HIPK2蛋白相对表达量（（19±3.8）％）比较，下降53％，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论： miR-27a在卵巢癌耐紫杉醇细胞中高表达，可能通过调控靶基因HIPK2，间接调节MDR1/P-gp的表达和功能，参与耐药。转染miR-27a inhibitors后，可以下调P-gp表达和功能，增加A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性，部分逆转耐药。
　　 第三部分:has-miR-451与乳腺癌耐阿霉素细胞耐药关系的研究
　　 目的：研究has-miR-451与乳腺癌耐阿霉素细胞耐药关系的研究。
　　 方法：利用脂质体Lipofectamine 2000将成熟miR-451的模拟物mimics及阴性对照negative control RNA (NC) 转染MCF-7/ADM细胞；Real-time PCR技术和western blot技术分别检测转染后MCF-7/ADM细胞的MDR1mRNA和P-gp蛋白表达；MTT检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞内阿霉素蓄积量。
　　 结果：MCF-7/ADM细胞转染miR-451mimics后（1）MDR1mRNA表达明显下降，与转染NC组细胞相比，表达下降（65±12）％，差异有显著性（P＜0. 05）；（2）P-gp蛋白相对表达量（（31±19）％）与转染NC组细胞P-gp蛋白相对表达量（（83±12）％）相比，下降62％，差异有显著性（P＜0. 05）；（3）对阿霉素的敏感性增加，IC50为4.61μM，与转染NC组细胞IC5026 μM相比，有显著性差异（P＜0. 05）；（4）细胞内的阿霉素荧光强度增加为28.98±2.9，与转染NC组细胞的11.64±2.6相比有显著性差异（P＜0. 05）。
　　 结论：miR-451在乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/ADM中低表达，它可能通过负性调控靶基因P-gp蛋白参与乳腺癌耐阿霉素的发生。转染miR-451mimics后，可以增加MCF-7/ADM细胞对阿霉素的敏感性，部分逆转耐药。

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前言

第一部分has-miR-27a和has-miR-451在P-glycoprotein高表达的耐药肿瘤细胞中的表达

第二部分has-miR-27a与卵巢癌耐紫杉醇细胞耐药关系的研究

第三部分has-miR-451与乳腺癌耐阿霉素细胞耐药关系的研究

综述：microRNA与肿瘤耐药的关系

攻读博士学位期间完成的学术论文

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