肿瘤细胞Survivin、GRP78的表达与其双干扰siRNA协同诱导肝癌细胞凋亡及其机制

摘要

目的：肿瘤的发生发展是一非常复杂的过程，涉及多因素的参与，其病因及发生机制尚不完全清楚，研究证明Survivin 选择性高表达于多种肿瘤，与肿瘤的级别增高、高复发率和病人的低存活率相关联，而在正常组织低表达，沉默其表达可作为诱导肿瘤细胞凋亡的策略，然而通过沉默Survivin的表达诱导肿瘤细胞凋亡并未取得满意的效果。有研究表明，肿瘤发生过程中，肿瘤细胞异常高表达GRP78以对抗凋亡并促进肿瘤的耐药、复发及转移。GRP78在内质网中可促进蛋白质的正确折叠，维持内质网正常功能；在核内，可与DNA结合上调抗凋亡分子的表达；在胞浆可与caspase7、12结合，阻止caspase12释放入胞浆后所启动的内质网应激及其诱导的凋亡级联反应。因此，当微环境存在各种不利因素时，肿瘤细胞可通过异常高表达GRP78以对抗凋亡。本课题组前期研究证明，在胃癌组织高表达GRP78，推测与其肿瘤发生发展有关。在此基础上本课题研究检测了Survivin和GRP78在肝细胞癌患者的组织标本和肿瘤细胞系中的表达，进一步构建了沉默Survivin和GRP78的双干扰siRNA 质粒，并探讨了沉默肿瘤细胞Survivin和GRP78基因协同诱导肿瘤细胞凋亡的效应及其可能的机制。
　　 方法：
　　 1.免疫组化法检测临床肝细胞癌组织标本Survivin和GRP78的表达对31例肝细胞癌组织石蜡块切片标本进行免疫组化法检测癌灶和癌旁组织Survivin和GRP78的表达。
　　 2.流式细胞术间接免疫荧光法检测HepG2等肿瘤细胞Survivin和GRP78表达
　　 用兔抗人Survivin/羊抗人GRP78和FITC标记的羊抗兔二抗/驴抗羊二抗检测肿瘤细胞胞GRP78的表达；0.1％的皂苷破膜后检测肿瘤细胞胞浆Survivin和GRP78的表达。利用CellQuest软件进行参数获取和资料分析。
　　 3.荧光显微镜观察肝癌细胞HepG2和肝细胞L02胞内Survivin和GRP78的表达收集体外培养的HepG2和肝细胞L02细胞，细胞爬片后用兔抗人Survivin/羊抗人GRP78和FITC标记的羊抗兔二抗/驴抗羊二抗孵育，用Olympus BX51荧光显微镜观察盖玻片上细胞Survivin/GRP78的表达。
　　 4.干扰质粒载体构建使用Ambion Target finder设计Survivin和GRP78mRNA的干扰序列，采用分子克隆技术构建特异性沉默 Survivin、GRP78及沉默Survivin/GRP78双干扰siRNA，所有质粒均带增强型GFP基因作为荧光标记，分别命名为pgsiRNA-sur1、pgsiRNA-sur2，pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp，无关对照质粒为pgsiRNA-C。
　　 5.细胞转染用LipofectamineTM2000将pgsiRNA-C、pgsiRNA-sur、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp质粒分别转染肝癌细胞株HepG2，转染后48h收集细胞检测。
　　 6.流式细胞术检测细胞转染效率，荧光显微镜观察GFP表达收集细胞于离心管中，采用流式细胞仪检测GFP的表达；利用CellQuest软件进行参数获取和分析。利用倒置荧光显微镜观察转染阳性细胞GFP的表达。
　　 7.Real-Time PCR检测转染细胞胞内Survivin和GRP78mRNA的表达提取细胞总RNA，逆转录cDNA，荧光定量PCR检测干扰质粒pgsiRNA-sur、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp转染细胞Survivin和GRP78 mRNA的表达。
　　 8.Western Blot检测转染后胞内survivin和GRP78蛋白的表达提取细胞总蛋白，分离、转膜后，用兔抗人Survivin多克隆IgG抗体/羊抗人GRP78多克隆IgG抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗/辣根过氧化物酶标记的驴抗羊IgG二抗检测干扰质粒pgsiRNA-sur、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp转染细胞Survivin和GRP78蛋白的表达。
　　 9.MTT法检测转染干扰质粒后细胞增殖细胞转染后24、48、72h进行MTT染色，用酶联测定仪在570nm波长检测每孔的光密度值（OD值），检测细胞增殖率＝（实验管OD值/对照管OD值）×100％。
　　 10.FCM测定肿瘤细胞凋亡干扰质粒转染后48h收集细胞，AnnexinV-APC和 PI染色，FCM检测肿瘤细胞的凋亡。利用CellQuest软件进行参数获取和资料分析。
　　 结果：
　　 1.肝癌组织中Survivin和GRP78的表达：免疫组化检测结果显示，肝癌组织中癌细胞胞浆染色Survivin和GRP78阳性细胞的比例均明显高于癌旁肝组织，差异有统计学意义(P<0.01)；2．肿瘤细胞株Survivin和GRP78的表达：在L02、K562、Raji及HepG2细胞株中GRP78 mRNA的表达无显著差异，GRP78 mRNA在AGS、HeLa、7721和MCF-7细胞株中表达量高于L02。在L02和HepG2、Raji及K562肿瘤细胞株中，仅在MCF-7胞膜GRP78相对高表达，其他细胞株不表达或少量表达。HepG2胞浆中Survivin高于L02。3．不同siRNA载体鉴定结果：pgsiRNA-sur1、pgsiRNA-sur2、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp通过酶切、测序结果表明干扰载体构建成功。4．pgsiRNA-sur沉默效应与抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡：针对Survivin不同序列的siRNA干扰质粒转染人肝癌细胞株HepG2，Real Time PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白的表达，结果表明，pgsiRNA-sur1和pgsiRNA-sur2均可沉默Survivin mRNA和蛋白的表达，MTT法检测细胞增殖以及FCM检测细胞凋亡结果显示，pgsiRNA-sur1和pgsiRNA-sur2均可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，但pgsiRNA-sur2沉默Survivin和诱导细胞凋亡效果更明显。同时研究发现转染pgsiRNA-sur的人肝癌细胞株HepG2与转染无关质粒pgsiRNA-C和未转染对照组比较，转染pgsiRNA-sur的HepG2细胞内质网应激蛋白 GRP78表达水平升高，转染无关质粒pgsiRNA-C与未转染对照组比较无显著差异。5．Survivin和GRP78双干扰RNA沉默效应与抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡：pgsiRNA-sur2与pgsiRNA-grp以及pgsiRNA-sur2+grp转染人肝癌细胞株HepG2，MTT法检测细胞增殖以及FCM检测细胞凋亡结果显示，pgsiRNA-sur2+grp抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡效应显著高于转染单干扰质粒及对照质粒组差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 结论：肝细胞癌组织中Survivin和GRP78高表达；肝癌细胞株HepG2中Survivin高表达，主要位于细胞质，而胞质GRP78表达与L02无显著性差异，与肝癌组织中GRP78表达水平不一致，提示在体内，肝癌细胞可能遭受肿瘤微环境的压力，诱导GRP78高表达；针对Survivin的siRNA质粒pgsiRNA-sur2可有效沉默Survivin mRNA和蛋白的表达，并可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡；并且发现siRNA沉默Survivin的表达亦可上调HepG2细胞内内质网应激蛋白GRP78的表达。进一步研究证明Survivin/GRP78双干扰siRNA能够有效沉默HepG2细胞Survivin和GRP78基因的表达，诱导肿瘤细胞凋亡；并且证明pgsiRNA-sur2沉默Survivin基因的表达以及诱导细胞凋亡效应较pgsiRNA-sur1更好，双干扰siRNA pgsiRNA-sur+grp沉默Survivin和GRP78基因的表达以诱导细胞凋亡效应最强。结果表明沉默Survivin基因表达在诱导细胞凋亡同时，诱导GRP78的表达可能具有抗凋亡作用，双干扰Survivin和GRP78基因的表达具有协同诱导肿瘤细胞凋亡效应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

主要仪器和器材

实 验 材 料

第一部分 肿瘤细胞Survivin、GRP78的表达

第二部分 Survivin/GRP78双干扰siRNA协同诱导肝癌细胞凋亡效应

小 结

研究结果的提示及需进一步研究之处

综述 GRP78的应激诱导及在肿瘤治疗和预后中的作用探讨

致 谢