神经元细胞周期调控异常在帕金森病发病机制中作用的研究

摘要

第一部分，第一节目的：建立PD细胞模型，并观察各种PD相关损伤因素对神经元样PC12细胞周期分布的影响。
　　 方法：体外培养神经元样PC12细胞，分别用不同浓度的多巴胺神经毒素(6-OHDA、MPP+和lactacystin)处理细胞，四甲基偶氮唑盐法 (MTT法)检测细胞活性，Annexin-V/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡率，PI单标流式细胞术检测细胞周期分布，并观察细胞周期抑制药物flavopiridol对细胞周期、细胞活性和细胞凋亡的影响。
　　 结果：PC12细胞经神经生长因子诱导后具有神经元的表型，各种神经毒素处理后细胞活性呈浓度依赖性和时间依赖性下降，10μM lactacystin、75 μM MPP+和100μM 6-OHDA使PC12细胞活力分别下降到对照组的49.31±3.23％、59.75±6.50％和48.32±9.43％。流式细胞术检测发现细胞死亡的主要方式为凋亡，且细胞凋亡率随各种神经毒素处理时间的延长而升高。细胞周期检测发现，神经元样PC12细胞71.27％处于G0/G1期，各种神经毒素处理后，G0/G1期细胞比例减少，而S期和G2/M期细胞比例升高。细胞周期抑制剂flavopiridol能够抑制细胞周期重启和细胞损伤。
　　 结论：线粒体功能障碍、氧化应激和泛素-蛋白酶体功能障碍等PD相关损伤因素能够诱导神经元细胞周期重启，细胞周期重启参与神经元损伤过程。
　　 第二节，目的：观察各种PD相关损伤因素对神经元样PC12细胞周期调节因子表达的影响。
　　 方法：体外培养神经元样PC12细胞，分别用lactacystin (10μM)、6-OHDA (100μM)和MPP+(75 μM)处理细胞，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察细胞周期调节因子cyclin (cyclin A、cyclin D1、cyclin B1和cyclin E)和CDK (CDK2、CDK4和CDK1) mRNA表达水平的变化，Western blot和免疫细胞化学染色观察细胞周期调节因子pRB、p-pRB、cyclin B1、CDK4和CDK1蛋白表达水平的变化。
　　 结果：RT-PCR结果显示，各种多巴胺神经毒素处理后，神经元样PC12细胞cyclin A、cyclin D1和CDK1mRNA表达水平升高，而cyclin B1、cyclin E、CDK2和CDK4 mRNA水平无明显改变。Western blot和免疫细胞化学染色显示，lactacystin处理后PC12细胞内pRB蛋白磷酸化水平增高，同时cyclin B1、CDK1和CDK4蛋白表达水平增高。
　　 结论：各种多巴胺神经毒素通过上调细胞周期调节因子的表达(cyclin A、cyclin D1和CDK1)或抑制其降解(cyclin B1和CDK4)促进神经元细胞周期重启。
　　 第二部分，目的：探讨神经元细胞周期重启后的DNA复制机制及其在神经变性中的作用。
　　 方法：MPP+处理原代培养的小脑颗粒细胞(CGCs)，MTT法检测细胞活性，Annexin-V/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡率，PI单标流式细胞术检测细胞周期分布，BrdU掺入法检测S期细胞比例，Western blot法检测细胞周期调节因子(cyclin A和cyclin B)和各种DNA聚合酶(DNA pols)表达水平的变化，并观察细胞周期抑制剂(flavopiridol和olomoucine)和各种DNA pols抑制剂对细胞活性的影响，细胞内转染dominant negative DNA pol-β，观察其对细胞活性和细胞凋亡的影响。
　　 结果：MPP+处理后原代CGCs细胞活性下降和细胞凋亡，同时CGCs细胞周期重启，S期细胞增多，S期相关调节因子cyclin A表达增高，而G2/M期相关调节因子cyclin B表达水平无明显变化。细胞周期抑制剂flavopiridol和olomoucine都能够抑制MPP+引起的细胞周期重启和细胞凋亡。MPP+处理后DNA pol-β和DNA引物酶表达升高，而DNA pol-δ和pol-ε表达无明显变化。DNA pol-α/δ抑制剂阿非迪霉素对细胞活性和细胞凋亡率无明显影响，而DNA pol-β抑制剂双脱氧胞苷能够抑制MPP+诱导的细胞损伤，细胞内表达dominant negative DNA pol-β也能够抑制MPP+引起的细胞活性下降和细胞凋亡。
　　 结论：神经元细胞周期重启后由DNA pol-β介导DNA复制和细胞损伤。
　　 第三部分，第一节目的：观察MAPK信号通路在MPP+诱导的PC12细胞周期重启和细胞损伤中的作用。
　　 方法：MPP+处理神经元样PC12细胞，四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活性，Annexin-V/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡率，PI单标流式细胞术检测细胞周期分布，Western blot法观察ERK1/2、JNK和P38信号通路活化状态。分别使用ERK1/2通路抑制剂(PD98059)、JNK通路抑制剂(SP600125)和P38通路抑制剂(SB202190)预处理PC12细胞，观察其对神经元细胞周期和细胞活性的影响。
　　 结果：MPP+处理后PC12细胞内ERK1/2、JNK和P38磷酸化水平均增高，ERK1/2通路抑制剂PD98059能够抑制ERK1/2通路活化水平，同时能够抑制细胞周期重启和细胞活性下降。JNK通路抑制剂SP600125能够抑制细胞活性下降，但对细胞周期无明显影响。P38通路抑制剂SB202190对细胞活性和细胞周期均无显著影响。
　　 结论：ERK1/2信号通路是介导细胞周期重启的上游机制。
　　 第二节，目的：观察氧化应激在ERK1/2通路活化和细胞周期重启中的作用。
　　 方法：MPP+处理神经元样PC12细胞，四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活性，PI单标流式细胞术检测细胞周期分布，荧光比色法检测细胞内活性氧物质(ROS)水平，Western blot法检测ERK1/2信号通路活化状态。并观察过氧化氢酶预处理对ERK1/2通路活化、细胞周期重启和细胞活性的影响。
　　 结果：MPP+处理后PC12细胞内ROS水平增高，过氧化氢酶预处理能够抑制细胞内ROS水平升高，同时能够抑制MPP+诱导的ERK1/2通路活化、细胞周期重启和细胞活性下降。
　　 结论：氧化应激能够诱导ERK1/2信号通路活化和细胞周期重启。
　　 第三节，目的：观察桑黄素在PD细胞模型和动物模型中的神经保护作用及其机制。
　　 方法：MPP+处理神经元样PC12细胞，四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活性，Annexin-V/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡率，PI单标流式细胞术检测细胞周期分布，荧光比色法检测细胞内活性氧物质(ROS)水平。MPTP腹腔注射建立小鼠PD模型，高效液相色谱法检测纹状体多巴胺水平，酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色检测黑质多巴胺能神经元数量。
　　 结果：MPP+处理后神经元样PC12细胞活性下降，细胞内ROS水平增高，同时出现细胞周期重启，桑黄素能够明显抑制MPP+诱导的细胞活性下降、细胞凋亡和细胞内ROS水平升高，同时还能够抑制MPP+引起的细胞周期重启。MPTP小鼠模型纹状体内多巴胺水平下降，黑质多巴胺能神经元减少，桑黄素腹腔注射能够明显升高PD小鼠模型纹状体多巴胺水平，同时黑质内多巴胺能神经元数量增多。
　　 结论：桑黄素对PD细胞模型和动物模型都具有明显的神经保护作用，其保护作用的机制可能与其抗氧化、抗增殖活性有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

声明

研究背景

第一部分帕金森病相关损伤因素对神经元细胞周期调控的影响

第二部分神经元细胞周期重启后的DNA复制机制及其在神经变性中的作用

第三部分神经元细胞周期重启的上游机制研究

研究内容小结

综述细胞周期调控异常在神经变性疾病发病机制中的作用

攻读学位期间发表论文

致谢