肺炎衣原体诱导THP-1源性巨噬细胞胆固醇代谢稳态失衡的信号机制研究

摘要

第一部分，目的：观察肺炎衣原体（C.pneumoniae）对人单核细胞株（THP-1）源性巨噬细胞内胆固醇含量及参与胆固醇代谢的关键基因，包括清道夫受体A1（SR-A1）、酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）、ATP结合盒转运体A1（ABCA1）和ATP结合盒转运体G1（ABCG1）表达的影响。
　　 方法：在宿主细胞人喉上皮癌（Hep-2）细胞内繁殖C.pneumoniae。体外培养THP-1单核细胞，以160nmol/L佛波酯（PMA）诱导THP-1细胞48 h后，分化为巨噬细胞。随机分为5组：⑴对照组；⑵ 1×105 IFU C.pneumoniae感染组；⑶ 4×105 IFU C.pneumoniae感染组；⑷ 5×105 IFU C.pneumoniae感染组；⑸ 1×106 IFU C.pneumoniae感染组。以上各组均在50μg/ ml LDL存在条件下，孵育48 h。采用透射电镜法鉴定C.pneumoniae对THP-1源性巨噬细胞的感染。运用酶化学法进行细胞内总胆固醇（TC）和胆固醇酯（CE）含量分析，油红O染色法观察细胞浆内脂滴含量并进行泡沫细胞计数，使用RT-PCR法检测SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1基因表达，使用Western-blot的方法检测SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1蛋白的表达。
　　 结果：随着C.pneumoniae感染浓度的递增，TC和CE含量逐渐增多，细胞内的脂质含量明显增加、泡沫细胞数逐渐增多，SR-A1、ACAT1基因和蛋白表达逐渐增加，且ABCA1/G1基因和蛋白表达也逐渐减少。
　　 结论：C.pneumoniae感染THP-1源性巨噬细胞后，通过增加SR-A1和ACAT1表达，减少ABCA1/G1表达，增加胆固醇摄入和胆固醇酯合成，减少胆固醇流出，诱导巨噬细胞内的胆固醇代谢稳态失衡。
　　 第二部分，目的：观察PPAR γ信号通路在C.pneumoniae调控巨噬细胞内胆固醇代谢关键基因SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1表达中的作用。
　　 方法：体外培养THP-1单核细胞，以160nmol/L PMA诱导THP-1细胞48 h后，分化为巨噬细胞。随机分为4组：⑴阴性对照组；⑵阳性对照组：给予1×106 IFU C.pneumoniae感染；⑶罗格列酮（PPAR γ特异性激动剂）干预组：分别给予1、10、20μM罗格列酮预孵2 h后，再给予1×106 IFU C.pneumoniae感染；⑷单纯罗格列酮组：单纯给予20μM罗格列酮预孵2 h。以上各组均在负荷50μg/ ml LDL的条件下，孵育48 h。运用酶化学法进行细胞内总胆固醇（TC）和胆固醇酯（CE）含量分析，油红O染色法观察细胞浆内脂滴含量并进行泡沫细胞计数，使用RT-PCR法检测PPAR γ、SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1基因表达，使用Western-blot的方法检测PPAR γ、SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1蛋白的表达。
　　 结果：随着C.pneumoniae感染浓度的递增，PPAR γ基因和蛋白的表达逐渐减少。与阳性对照组相比，罗格列酮干预后不仅呈剂量依赖性地抑制C.pneumoniae诱导的SR-A1、ACAT1基因和蛋白表达增加，而且呈剂量依赖性地抑制C.pneumoniae诱导的ABCA1/G1基因和蛋白表达减少。提示PPAR γ参与了C.pneumoniae通过调控细胞内胆固醇代谢关键基因SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1的表达，从而破坏胆固醇代谢稳态的过程。
　　 结论：C.pneumoniae 感染部分通过PPAR γ信号通路，增加ACAT1、SR-A1表达，减少ABCA1/G1表达，增加胆固醇摄入和胆固醇酯合成，减少胆固醇流出，从而诱导THP-1源性巨噬细胞胆固醇代谢稳态的失衡。
　　 第三部分，目的：观察c-Jun氨基末端激酶（JNK）在C.pneumoniae通过PPAR γ信号通路调控巨噬细胞内胆固醇代谢关键基因SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1表达中的作用。
　　 方法：体外培养THP-1单核细胞，以160nmol/L佛波酯（PMA）诱导THP-1细胞48 h后，分化为巨噬细胞。随机分为4组，⑴阴性对照组；⑵阳性对照组：给予1×106 IFU C.pneumoniae感染；⑶ SP600125（JNK特异性抑制剂）干预组：分别给予1、10、20μM的SP600125预孵2 h后，再给予1×106 IFU C.pneumoniae感染；⑷单纯SP600125组：单纯给予20μM SP600125预孵2 h。以上各组均在负荷50μg/ ml LDL的条件下，孵育48 h。运用酶化学法进行细胞内总胆固醇（TC）和胆固醇酯（CE）含量分析，油红O染色法观察细胞浆内脂滴含量并进行泡沫细胞计数，使用RT-PCR法检测PPAR γ、SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1基因表达，使用Western-blot的方法检测PPAR γ、SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1蛋白的表达。
　　 结果：与阳性对照组相比， SP600125干预后不仅呈剂量依赖性地抑制C.pneumoniae感染对PPAR γ表达的减少，而且呈剂量依赖性地抑制C.pneumoniae感染调控的PPAR γ的下游靶基因SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1的表达（p＜0.05）。提示JNK参与了C.pneumoniae通过PPARγ信号通路调控SR-A1、ACAT1、ABCA1/G1的表达，破坏胆固醇代谢稳态的过程。
　　 结论：C.pneumoniae 部分通过JNK-PPAR γ信号通路，增加SR-A1、ACAT1基因和蛋白表达，减少ABCA1/G1基因和蛋白表达，增加胆固醇摄入和胆固醇酯合成，减少胆固醇流出，从而诱导THP-1源性巨噬细胞胆固醇代谢稳态的失衡。这可能为我们进一步探讨C.pneumoniae感染促进动脉粥样硬化的机制提供新的理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略表及中文对照

声明

前言

第一部分肺炎衣原体感染对THP-1源性巨噬细胞胆固醇代谢的影响

第二部分过氧化物酶体增殖物活化受体γ信号通路在肺炎衣原体诱导巨噬细胞胆固醇代谢稳态失衡中的作用

第三部分C-Jun氨基末端激酶信号通路在肺炎衣原体诱导巨噬细胞胆固醇代谢稳态失衡中的作用

结论

综述肺炎衣原体促动脉粥样硬化发生发展的作用机制

附录攻读博士学位期间发表文章目录

致谢