丙二醛对大鼠原代培养皮层神经元和学习记忆能力的损伤作用及其机制

摘要

目的：丙二醛（MDA）是多不饱和脂肪酸脂质过氧化的副产物，以往被用作氧化应激水平的评估指标，在许多神经系统疾病如脑缺血再灌注损伤、AD、PD等中MDA含量均有升高。肌肽是一种生理性二肽，作为内源性抗氧化剂，在脊椎动物脑内浓度可高达20 mM，最新研究发现肌肽有清除醛类的能力，可逆转这些有毒醛类对细胞的损伤，并有利于神经系统疾病的转归。因此，本实验通过比较MDA 与H2O2 对培养大鼠神经元损伤作用的差别，以及肌肽对MDA 诱导培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用，探讨MDA 诱导神经元损伤作用的机制。
　　 方法：采用MDA（100 μM）或H2O2（50 μM）处理细胞24 h 建立细胞氧化损伤模型，应用细胞增殖抑制实验（MTT法）评价细胞存活率；Annexin V/PI染色法流式细胞仪检测细胞坏死和凋亡；LDH assay和Hoechst 33258染色分别检测神经元坏死和凋亡；用DCF-DA染色方法检测细胞内ROS 生成及MitoTrack-Red染色辅助线粒体定位；JC-1染色标记线粒体膜电位改变；用SDS-PAGE 电泳检测细胞内高分子量聚集物的形成；用Western Blotting 方法检测MAPK 信号通路及相关凋亡蛋白BaX与Bcl-2的表达。
　　 结果：MDA 时间和剂量依赖性地降低培养大鼠皮层神经元的存活率，细胞凋亡和坏死均参与其中；MDA 使细胞内ROS大量生成，同时伴随线粒体功能失常，表现为线粒体膜电位（ψm ⊿）的下降；细胞内JNK 激活而ERK 失活。与普通抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）相比，肌肽对MDA 细胞损伤的保护作用更好，它不仅能逆转ψm ⊿的下降、ROS 生成和MAPK表达改变，而且还能抑制MDA 导致的蛋白质交联。
　　 结论：MDA以蛋白交联/线粒体功能失调/ROS大量生成/MAPK 通路损伤神经元，肌肽能够完全阻断此通路从而发挥神经元保护作用而NAC 则仅可抑制Bcl-2 家族相关MAPK的活性，故其保护作用不及肌肽。与其他传统抗氧化剂相比，肌肽优先去除MDA蛋白交联毒性进而更好保护MDA 神经元损伤的能力，提示它是神经系统疾病治疗的一个潜在开发药物。
　　 目的：不同种类和浓度的ROS 对LTP 有不同的调控作用，MDA 作为ROS 脂质过氧化下游产物，其本身对于大鼠学习记忆能力以及海马LTP的影响尚无研究。因此，本研究旨在观察MDA对大鼠空间学习能力及海马DG区LTP的影响及其可能的机制。
　　 方法：Morris 水迷宫用来评价海马相关空间工作学习记忆能力，海马PP-DG 通路在体场电位LTP 记录来检测MDA 对LTP的影响及相关影响因素，免疫组化及WesternBlotting 结合探讨MDA 损伤学习记忆过程中相关分子机制的参与。
　　 结果：（1）1，10，100 mM MDA 可剂量依赖性地损伤海马相关空间学习记忆能力，Morris 水迷宫实验表明MDA 预处理大鼠在目标象限停留时间较对照组明显减少，并且趋向于在外环区域活动。（2）MDA 剂量依赖性地损伤大鼠海马PP-DG 通路LTP的诱导，10和100 mMMDA 可引起LTP 诱导幅值的明显降低。（3）HFS 诱导的LTP 需要NMDA 受体的激活及[Ca2+]I的增加，MDA 抑制LTP 主要是通过抑制NMDA 受体的功能实现的。（4）MDA主要通过抑制突触后PKA和PKC/CaMKⅡ/MAPK 信号通路分子活性而发挥抑制LTP的作用。（5）MDA 导致的海马细胞凋亡可能也参与了其导致的海马相关空间学习记忆能力受损和LTP 损伤。
　　 结论：MDA 可浓度依赖性地损伤海马相关空间学习记忆能力及PP-DG LTP，该损伤主要通过抑制突触后膜NMDA 受体及[Ca2+]I 增加，进而抑制PKA及PKC/CaMKⅡ/MAPK 信号通路，并且海马区神经元凋亡也参与此过程中。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

前言

第一部分MDA对原代培养大鼠皮层神经元的损伤作用

第二部分MDA损伤大鼠海马DG区LTP及空间学习记忆能力

全文总结

创新点与展望

综述MDA作为毒性小分子的近期研究进展

攻读博士期间发表及待发表论文

致谢